大白豬CXCL8的克隆表達(dá)及生物學(xué)活性研究.pdf

1、CXCL8是一種CXC趨化因子，可激活和趨化中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等。中性粒細(xì)胞可向感染處聚集并參與炎癥反應(yīng)，該反應(yīng)受CXCL8的調(diào)節(jié)，迅速、強(qiáng)烈，是宿主防御的第一道防線。但是，炎癥過程中過量的中性粒細(xì)胞浸潤也會導(dǎo)致過度炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致宿主組織細(xì)胞被破壞。在大部分豬病發(fā)生發(fā)展過程中，炎癥是最主要的病理變化，而CXCL8在這些疾病過程中也起重要的作用。大白豬是我國養(yǎng)豬業(yè)重要的豬種之一，目前對大白豬CXCL8的研究報(bào)道比較少。本研究克

2、隆了大白豬CXCL8基因，對CXCL8及CXCL8的突變體(G58P)進(jìn)行可溶性表達(dá)，并驗(yàn)證了它們的生物學(xué)活性，為進(jìn)一步研究豬CXCL8的功能與作用機(jī)制，開發(fā)抑制豬炎癥的靶向性藥物提供了基礎(chǔ)。主要研究內(nèi)容如下:
　　1.大白豬CXCL8及G58P的克隆與表達(dá)純化
　　提取大白豬肺組織mRNA，利用RT-PCR擴(kuò)增CXCL8基因。測序正確后將該基因克隆至pGEX-6p-1載體上，獲得重組質(zhì)粒pGEX-PCXCL8。轉(zhuǎn)化至大腸桿

3、菌Rosetta中，經(jīng)表達(dá)條件的優(yōu)化，外源基因在上清中高效表達(dá)。通過蛋白純化系統(tǒng)AKTA prime10純化目的蛋白，SDS-PAGE及Western Blot顯示蛋白純化效果較好。將CXCL8第58位甘氨酸(G)突變?yōu)楦彼?P)，根據(jù)相應(yīng)的堿基序列合成CXCL8突變體基因G58P，利用DNA重組技術(shù)將其克隆至pGEX-6p-1載體上，按照上述方法表達(dá)純化G58P蛋白。
　　2.CXCL8的體內(nèi)活性驗(yàn)證
　　將重組蛋白用生

4、理鹽水稀釋到4mg/mL、400μg/mL、40μg/mL、4μg/mL，分別以25μL不同濃度的PCXCL8重組蛋白對BALB/c小鼠進(jìn)行滴鼻，同時(shí)設(shè)置相同濃度的GST蛋白對照組及生理鹽水空白對照組。12h后剖殺所有小鼠，取肺進(jìn)行組織病理學(xué)觀察，BALF中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)，肺組織MPO活力檢測來評估重組蛋白的生物學(xué)活性。組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)不同濃度的PCXCL均可引起小鼠肺炎，4mg/mL GST組有輕微的炎癥，其余濃度GST組與生理鹽水對

5、照組沒有明顯異常;PCXCL8實(shí)驗(yàn)組MPO活力均顯著高于GST對照組及生理鹽水組;4mg/mL PCXCL8滴鼻組BALF中性粒細(xì)胞數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于GST組。
　　3.G58P的體內(nèi)活性驗(yàn)證
　　實(shí)驗(yàn)組以4mg/mL濃度G58P25μL劑量滴鼻處理BALB/c小鼠，同時(shí)設(shè)置PCXCL8陽性對照組，PCXCL8與G58P混合組，生理鹽水對照組，不作處理的空白對照組。12h后剖殺所有小鼠，取肺臟。通過組織病理學(xué)觀察，BALF中性粒細(xì)

6、胞計(jì)數(shù)，肺組織MPO活力檢測來評估G58P的生物學(xué)活性。組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組、混合組、PCXCL8對照組均呈現(xiàn)肺炎特征，生理鹽水對照組與空白對照組沒有明顯異常;實(shí)驗(yàn)組、混合組、PCXCL8對照組MPO活力無顯著差異，但均顯著高于生理鹽水對照組和空白對照組;實(shí)驗(yàn)組、混合組、PCXCL8對照組BALF中性粒細(xì)胞數(shù)目無顯著差異，但均顯著高于生理鹽水對照組和空白對照組。
　　結(jié)論:利用原核表達(dá)載體pGEX-6p-1，可以對PCXCL8