植物谷胱甘肽合成酶(GSHI)的表達(dá)純化及其對溫度變化的應(yīng)答.pdf

1、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶GSHⅠ(γ-glutamylcysteine synthetaseγ-ECS)，又稱谷氨酰-L-半胱氨酸連接酶，是谷胱甘肽(GSH)合成過程第一步的催化酶，由于合成產(chǎn)物GSH可通過反饋抑制調(diào)控GSHⅠ的活性，GSHⅠ被認(rèn)為是GSH生物合成途徑中的限速酶（在某些逆境條件下，如在Cd脅迫過程中GSHⅡ(GSH合成酶)可能成為GSH合成途徑的限制酶）。本論文將主要對GSHⅠ在溫度上的活性變化及其在轉(zhuǎn)錄水平上的響應(yīng)進(jìn)行

2、初步探索。
　　Ullmann等在1996年首次從擬南芥(Arabidopsis thaliana)中克隆了植物GSH合成酶基因。此后，植物谷胱甘肽合成酶基因陸續(xù)在豌豆（Pisum sativum）、蒺藜狀苜蓿（Medicago truncatula）、大豆（Glycine max）、玉米(Zea mays)、小麥（Triticumaestivum）和百日菊(Zinnia elegans)等植物中被克隆。Bloch最早證實(shí)細(xì)胞內(nèi)的

3、GSH是由GSHⅠ(EC6.3.2.2)與GSHⅡ(EC6.3.2.3)在ATP存在下催化L-谷氨酸(Glu)、L-半胱氨酸(Cys)和甘氨酸(Gly)的一個序貫反應(yīng)合成的。因此，要實(shí)現(xiàn)GSH的高效合成，GSH合成酶系的高活性和ATP的有效供給是兩個必須滿足的條件。細(xì)胞內(nèi)GSHⅠ活性提高使GSH合成加速，從而提高細(xì)胞內(nèi)外GSH濃度。GSHⅠ活性的調(diào)節(jié)可在基因轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平、翻譯后水平等環(huán)節(jié)，但主要在基因轉(zhuǎn)錄水平。
　　本論文

4、首次嘗試在pETM載體系統(tǒng)中進(jìn)行擬南芥（Arabidopsis thaliana）的GSHⅠ和GSHⅡ的融合和非融合表達(dá)。從擬南芥的cDNA文庫中分別克隆GSHⅠ和GSHⅡ，采用原核表達(dá)技術(shù)，將其轉(zhuǎn)入pETM系列原核表達(dá)載體中，與載體中的硫氧還蛋白基因(TrxA)相融合，便于融合蛋白表達(dá)后的純化。SDS-PAGE分析表明，只有融合基因GSHⅠ-TrxA通過E.coli在適當(dāng)溫度下經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后得到了過量表達(dá)的融合蛋白。
　　本論

5、文通過應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR對煙草(Nicotiana megalosiphon)在極限溫度脅迫下進(jìn)行相對定量。結(jié)果表明，煙草同擬南芥一樣在4℃低溫條件下，GSHⅠ被大量誘導(dǎo)表達(dá)，但是在40℃時表達(dá)受到抑制，表達(dá)量降低，其機(jī)理有待進(jìn)一步的研究工作。
　　本實(shí)驗(yàn)成功對擬南芥中的GSHⅠ進(jìn)行了融合表達(dá)和純化，為了對GSHⅠ和GSHⅡ在細(xì)胞中的動態(tài)研究奠定基礎(chǔ)，對在一個質(zhì)粒中同時表達(dá)兩個酶做了嘗試性的工作，并成功的表達(dá)了一個雙亞基的酶E

6、.coli Integration Host Factor(IHF);對在一個載體中同時表達(dá)合成鏈中兩個酶積累了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對載體合成酶系構(gòu)建提供了良好的基礎(chǔ)，也對用構(gòu)建工程菌表達(dá)植物細(xì)胞內(nèi)相互作用或關(guān)聯(lián)的蛋白或酶提供了很好的思路和方法，在植物基因工程研究方面具有重要的意義。同時，本論文首次對能夠誘導(dǎo)煙草谷胱甘肽合成酶表達(dá)的溫度進(jìn)行了初步探索，證明了GSHⅠ可能具有協(xié)同抵御極限溫度脅迫的功能，為其在今后提高作物對環(huán)境抗逆作用的轉(zhuǎn)基因應(yīng)用提