不同來源的谷胱甘肽合成酶對重組畢赤酵母合成谷胱甘肽的影響研究.pdf

1、谷胱甘肽,γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸(γ-L-glutamyl-L-cysteinyl-gly-cine,GSH),廣泛存在于真核生物、革蘭氏陰性菌和部分革蘭氏陽性菌中,具有重要的生理功能和應(yīng)用前景。微生物發(fā)酵法是目前谷胱甘肽生產(chǎn)的主要方法之一,它具有生產(chǎn)成本低,步驟簡單、無需外源添加ATP等優(yōu)點(diǎn)。發(fā)酵法所用菌株主要是經(jīng)誘變育種得到各種酵母菌,包括釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母等。近幾年,重組畢赤酵母開始應(yīng)用于谷胱甘肽合成,由于該酵母

2、遺傳操作簡便、極易在廉價(jià)培養(yǎng)基上實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng),因此已初步顯示出其在谷胱甘肽生產(chǎn)上的應(yīng)用價(jià)值與前景。
　　 用于谷胱甘肽生產(chǎn)的重組畢赤酵母菌株,是通過在畢赤酵母宿主中過表達(dá)催化谷胱甘肽合成酶的基因構(gòu)建而成,而選擇理想的(如催化效率高、無產(chǎn)物抑制等)谷胱甘肽合成酶進(jìn)行過表達(dá),也是提高畢赤酵母生產(chǎn)谷胱甘肽產(chǎn)率的先決條件。為得到相對理想的谷胱甘肽合成酶,最為簡單實(shí)用的方法之一是在畢赤酵母中嘗試表達(dá)各種微生物來源的谷胱甘肽合成酶基因,考

3、察這些合成酶對于畢赤酵母生產(chǎn)谷胱甘肽的影響。之前的研究只報(bào)道過在畢赤酵母中表達(dá)來源于釀酒酵母模式菌株S288c的L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶(γ-GCS)和谷胱甘肽合成酶(GS)基因。本論文考察了六種菌株來源的谷胱甘肽合成酶基因,研究了它們對畢赤酵母生產(chǎn)谷胱甘肽的影響。特別的,首次評估了革蘭氏陽性菌來源的雙功能谷胱甘肽合成酶基因(gshF)在畢赤酵母轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)谷胱甘肽中的應(yīng)用潛力。具體研究內(nèi)容包括:
　　 首先,考察了釀酒酵母

4、模式菌S288c,安琪酵母工業(yè)菌株和產(chǎn)朊假絲酵母來源的γ-GCS基因gsh1勺過表達(dá)對于谷胱甘肽產(chǎn)量的影響。通過將上述酵母的gshl基因和釀酒酵母來源的GS的基因gsh2分別克隆并插入到畢赤酵母GS115基因組內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。不加三種前體氨基酸搖瓶發(fā)酵結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們的重組子合成的GSH分別是出發(fā)菌的2.2倍、4.3倍和4.4倍,加入三種前體氨基酸后,對照組及重組子合成GSH的穩(wěn)定產(chǎn)量分別是116 mg/L、256 mg/L、426 mg/L和

5、438 mg/L。結(jié)果表明來源于模式菌S288c和產(chǎn)朊假絲酵母的γ-GCS基因?qū)入赘孰暮铣傻拇呋矢摺?br>　　 其次,考察了來源于革蘭氏陽性菌Listeria monocytogene、Lactobacillusplantarum和Streptococcus agalactia的雙功能谷胱甘肽合成酶基因(gshF)對于畢赤酵母產(chǎn)谷胱甘肽的影響。將L.monocytogenes,L.plantarum和S.agalactiae

6、來源的gshF分別克隆并插入到畢赤酵母GS115基因組內(nèi),得到三株重組菌株GS115/Lm-gshF GS115/Sa-gshF和GS115/Lp-gshF。搖瓶發(fā)酵結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有含L.Monocytogene gshF基因的重組子GS115/Lmg-shF合成的GSH是出發(fā)菌的2.8倍,GS115/SagshF、GS115/LpgshF兩重組子合成的GSH與出發(fā)菌相比沒有區(qū)別,在添加三種前體氨基酸的情況下,GS115/Lm-gshF合成