不同啟動(dòng)子對(duì)重組畢赤酵母高密度表達(dá)人胰島素前體的影響.pdf

1、胰島素是FDA批準(zhǔn)的第一個(gè)用于人類的基因重組藥物。最初的重組表達(dá)是通過(guò)大腸桿菌分別表達(dá)出胰島素的A鏈和B鏈。現(xiàn)在,胰島素作為重組蛋白產(chǎn)品,主要有兩條途徑獲得。一條途徑是在大腸桿菌中表達(dá)胰島素前體的包涵體,通過(guò)溶解和復(fù)性等過(guò)程獲得胰島素。另外一條途徑是通過(guò)酵母表達(dá)系統(tǒng),分泌表達(dá)可溶性的胰島素前體進(jìn)入培養(yǎng)液。由于對(duì)釀酒酵母大規(guī)模培養(yǎng)有豐富的經(jīng)驗(yàn),使其成為了第一個(gè)分泌表達(dá)胰島素前體的酵母系統(tǒng)。雖然釀酒酵母仍然是主要的胰島素產(chǎn)品表達(dá)系統(tǒng),近些年

2、幾個(gè)備選的表達(dá)系統(tǒng)也提供了可能性。其中,畢赤酵母是一種非常有用并且優(yōu)勢(shì)明顯的表達(dá)宿主。尤其是它強(qiáng)有力的醇氧化酶(Alcoholoxidase,AOX)啟動(dòng)子,受甲醇嚴(yán)格誘導(dǎo)調(diào)控,通過(guò)簡(jiǎn)單培養(yǎng)可以達(dá)到較高的細(xì)胞密度,能夠穩(wěn)定且高水平表達(dá)外源蛋白。
　　研究目的:構(gòu)建含短C肽AAK的人胰島素原類似物DesB30(HMPIDesB30 Human Mini-proinsulin DesB30)的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng),即 pPIC9K- HM

3、PIDesB30/ GS115、pGAPZαA-HMPIDesB30/GS115、pPIC9K-pGAPZαA- HMPIDesB30/GS115,通過(guò)搖瓶實(shí)驗(yàn)篩選出表達(dá)量高的工程菌株 FJ-H1、FJ-H2、 FJ-H3。優(yōu)化發(fā)酵條件,考察不同啟動(dòng)子對(duì)重組畢赤酵母高密度表達(dá)人胰島素前體的影響。
　　研究方法:構(gòu)建重組質(zhì)粒pGAPZαA-HMPIDesB30和pPIC9K-HMPIDesB30。分別用AvrII酶和SacⅠ酶線性化

4、pGAPZαA-HMPIDesB30和pPIC9K-HMPIDesB30并電轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株 GS115。利用含不同濃度 Zeocin或G418的平板篩選獲得多拷貝重組工程菌 pGAPZαA- HMPIDesB30/GS115和pPIC9K- HMPIDesB30/GS115。將重組質(zhì)粒pGAPZαA-HMPIDesB30,經(jīng)AvrII酶單酶切線性化后,電轉(zhuǎn)化至經(jīng)質(zhì)粒 pPIC9K- HMPIDesB30異位整合的胰島素原分泌菌株 pP

5、IC9K-HMPIDesB30/GS115,獲得工程菌株pPIC9K-pGAPZαA-HMPIDesB30/GS115。分別進(jìn)行搖瓶表達(dá)HMPIDesB30并篩選高表達(dá)菌株FJ-H1(pPIC9K-HMPIDesB30/GS115)、FJ-H2(pGAPZαA-HMPIDesB30/GS115)、 FJ-H3(pPIC9K-pGAPZαA-HMPIDesB30/GS115),進(jìn)行發(fā)酵工藝的研究。
　　研究結(jié)果:FJ-H3菌株的表達(dá)

6、量最高,可達(dá)到1.6 g/L,分別為FJ-H1(1.0 g/L)的1.6倍和FJ-H2(0.3 g/L)的5.3倍。說(shuō)明應(yīng)用AOX1和GAP雙啟動(dòng)子共表達(dá)體系能夠提高人胰島素原在畢赤酵母中的表達(dá)量。將FJ-H3表達(dá)的胰島素前體純化和酶切回收,通過(guò)12％Tricine SDS-PAGE、質(zhì)譜和肽圖分析出HMPIDesB30的分子量與理論分子量相符,FJ-H3表達(dá)的目的蛋白均一、正確。
　　結(jié)論:本研究實(shí)現(xiàn)了含短C肽的人胰島素原類似物