miR-139-5p在乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A中靶基因的鑒定及功能驗(yàn)證.pdf

1、每個(gè)miRNA都具有多個(gè)靶基因，因此對(duì)miRNA下游作用的靶基因進(jìn)行尋找及功能研究仍是臨床及科研的重要方向。而哺乳動(dòng)物乳腺組織是動(dòng)物體中少數(shù)的隨著年齡、發(fā)情周期和繁殖狀態(tài)而發(fā)生相應(yīng)周期性變化器官之一。因此對(duì)人乳腺中miR-139-5p靶基因的鑒定及驗(yàn)證至關(guān)重要。
　　研究發(fā)現(xiàn)miR-139與其靶基因共同作用可影響眾多生物學(xué)功能，如蛋白定位、細(xì)胞周期調(diào)控以及抑制腫瘤侵襲等。眾所周知，細(xì)胞周期的有序進(jìn)行是生物體生長、發(fā)育及繁殖的基礎(chǔ)，

2、而細(xì)胞周期加快或阻滯會(huì)影響細(xì)胞增殖及遷移能力，進(jìn)而至使腫瘤、癌癥以及基因突變的發(fā)生。為充分研究miR-139-5p的作用和功能，其靶基因的挖掘和鑒定及初步的功能驗(yàn)證成為急需解決的問題。
　　本研究將RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀(RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RIP)與新一代測(cè)序技術(shù)相結(jié)合，以MCF-10A細(xì)胞系為研究對(duì)象，鑒定與驗(yàn)證miR-139-5p在乳腺上皮細(xì)胞中的靶基因。先運(yùn)用針對(duì)

3、目標(biāo)蛋白Ago2的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來，然后經(jīng)過分離純化，對(duì)結(jié)合在復(fù)合物上的RNA進(jìn)行測(cè)序分析，找出成對(duì)樣品中的差異峰，進(jìn)而確認(rèn)miR-139-5p在MCF-10A中的靶基因，并對(duì)靶基因進(jìn)行KEGG和GO分析;最后運(yùn)用qPCR等技術(shù)對(duì)miR-139-5p的靶基因及miR-139-5p部分功能進(jìn)行驗(yàn)證。這些結(jié)果將為miR-139-5p在人乳腺中的功能研究提供新的參考。
　　研究結(jié)果如下:
　　(1) RIP-

4、seq測(cè)序數(shù)據(jù)處理及生物信息學(xué)分析:
　　RIP-seq測(cè)序后我們將由Negative Control組與miR-139-5p mimic組獲得的peak進(jìn)行比較，得到差異基因484個(gè)，這些差異基因就是miR-139-5p在MCF-10A細(xì)胞中的靶基因，這些靶基因可能是乳腺發(fā)育或乳腺進(jìn)化過程中重要的基因。利用KEGG對(duì)靶基因進(jìn)行通路分析，我們得到204種Pathway，其中顯著性通路有21條(P＜0.05)，涉及到120個(gè)靶基因;

5、在GO分析中發(fā)現(xiàn)，顯著性GO條目448個(gè)(P＜0.05)，主要涉及蛋白定位(proteinlocalization)、細(xì)胞周期調(diào)控(regulation of cell cycle)、細(xì)胞器組成（organdle part）、結(jié)合RNA(RNA binding)和結(jié)合核酸(nucleic acid binding)等;
　　(2) miR-139-5p靶基因的驗(yàn)證
　　選取的18個(gè)靶基因在mRNA水平被miR-139-5p顯