基于便攜式血糖儀檢測(cè)肉中鹽酸克倫特羅方法的研究.pdf

1、鹽酸克倫特羅（Clenbuterol Hydrochloride，CLB），又稱瘦肉精，化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，加熱溫度至172℃方可分解，極易在動(dòng)物組織中殘留。鹽酸克倫特羅對(duì)人體危害極大，消費(fèi)者食用含有瘦肉精的動(dòng)物肉，會(huì)引起急性中毒和慢性中毒。鹽酸克倫特羅是我國在動(dòng)物飼養(yǎng)過程中禁止使用的一種藥物，許多國家、國際組織均制定有嚴(yán)格的規(guī)定。
　　目前常用的檢測(cè)CLB的方法主要有酶聯(lián)免疫法、膠體金快速檢測(cè)試紙條、高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法和

2、生物傳感技術(shù)等，但這些方法分別適用不同的檢測(cè)對(duì)象，各有利弊。因此，開發(fā)一種靈敏、便捷的方法檢測(cè)肉中CLB的殘留十分必要。
　　本試驗(yàn)構(gòu)建了一種基于便攜式血糖儀檢測(cè)CLB殘留的方法。試驗(yàn)利用磁性分離技術(shù)，建立一種新型磁性免疫生物傳感探針檢測(cè)技術(shù)，利用便攜式血糖儀檢測(cè)免疫反應(yīng)引入的轉(zhuǎn)化酶催化底物產(chǎn)生的信號(hào)，準(zhǔn)確地定量CLB殘留。該方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、檢測(cè)成本低。
　　研究結(jié)果如下：
　?。?）以單分散羧基磁珠為載體，鹽

3、酸克倫特羅完全抗原（CLB-BSA）為標(biāo)記物制備磁性免疫傳感探針。通過單因素試驗(yàn)研究了CLB-BSA添加量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)偶聯(lián)率的影響；通過Box–Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，建立了偶聯(lián)率隨CLB-BSA添加量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間變化的回歸模型：Y=－151.943+7.700X2+6.095X3-0.0175X1X2+0.0125X1X3-0.01745X12-0.13625X22-0.2325X32?；貧w模型高度顯著，失擬項(xiàng)不顯著

4、，決定系數(shù)高(R2=0.9909)，可用于實(shí)際預(yù)測(cè)。自變量對(duì)偶聯(lián)率影響大小的次序?yàn)榉磻?yīng)溫度﹥反應(yīng)時(shí)間﹥CLB-BSA添加量。
　　通過響應(yīng)面法對(duì)磁性免疫傳感探針制備中CLB-BSA添加量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，得到制備條件的最佳參數(shù)為 CLB-BSA添加量41μg、反應(yīng)溫度25℃、反應(yīng)時(shí)間13 h。在最優(yōu)條件下進(jìn)行了5次驗(yàn)證，實(shí)際測(cè)得的平均偶聯(lián)率為15.22％，與理論值僅相差0.25%。
　　（2）制備膠體金/二抗/轉(zhuǎn)

5、化酶復(fù)合物（IgG-AuNPs-Invertase）的最佳膠體金溶液pH為8.5、轉(zhuǎn)化酶濃度為120μg/mL，兔抗羊IgG濃度為12μg/mL，轉(zhuǎn)化酶與兔抗羊IgG濃度比為10:1。
　　紫外-可見吸收光譜圖顯示，制備的膠體金溶液具有較好均一性，采用本試驗(yàn)的標(biāo)記方法，可成功使二抗、轉(zhuǎn)化酶標(biāo)記于膠體金表面；透射電鏡照片顯示，制備的IgG-AuNPs-Invertase顆粒均勻分散，顆粒周圍有一圈模糊可見的暈圈，同時(shí)粒徑變大，說明I

6、gG和Invertase被成功標(biāo)記到膠體金顆粒表面。
　?。?）本試驗(yàn)優(yōu)化了基于便攜式血糖儀檢測(cè)CLB殘留的測(cè)定條件，結(jié)果表明：免疫磁珠探針的用量25μg、CLB抗體1:800稀釋、IgG-AuNPs-Invertase稀釋度1:500；轉(zhuǎn)化酶參與水解反應(yīng)的最適溫度為55℃、時(shí)間為30 min。
　　（4）本試驗(yàn)構(gòu)建了一種基于便攜式血糖儀檢測(cè)CLB殘留的方法。試驗(yàn)表明，該方法靈敏度高，其檢測(cè)限為0.1 ng/mL，CLB濃度

7、在0.1～100 ng/mL的范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系，回歸方程決定系數(shù)（R2）為0.9969；在1 ng/g（低）、5 ng/g（中）、15 ng/g（高）添加水平下其回收率在85%～94%，標(biāo)準(zhǔn)差在5%以內(nèi)，說明本方法有較高的準(zhǔn)確度；批內(nèi)變異系數(shù)在1.2%～1.6%、批間變異系數(shù)在1.1%～8.8%，說明再現(xiàn)性和穩(wěn)定性較好；對(duì)沙丁胺醇和萊克多巴胺有極低的交叉反應(yīng)性，說明特異性好。
　?。?）向6份未檢出CLB的肉樣添加CLB