金免疫層析法檢測鹽酸克倫特羅的工藝研究.pdf

1、隨著免疫分析技術(shù)的發(fā)展及近幾年食品安全等問題不斷升級，金免疫層析技術(shù)以其特有的競爭優(yōu)勢在臨床、現(xiàn)場檢測和家庭自檢中發(fā)揮著越來越重要的作用，但國內(nèi)相關(guān)研發(fā)產(chǎn)品與國外卻存在著很大的差距。本文旨在通過鹽酸克倫特羅試紙條的工藝路線研究建立起從抗原設(shè)計到試紙條調(diào)試的整個免疫層析研發(fā)技術(shù)平臺。
　　 首先根據(jù)鹽酸克倫特羅的分子特征進(jìn)行抗原設(shè)計，目前市售產(chǎn)品的鹽酸克倫特羅完全抗原均采用重氮法合成，而本文則通過戊二醛法將抗原和偶聯(lián)蛋白通過“五碳

2、橋”連接起來，降低了載體蛋白的空間位阻效應(yīng)，使得戊二醛法合成的完全抗原(OVA-GA-CL，偶聯(lián)比25.2：1)相對于重氮法合成的完全抗原(OVA-CL，偶聯(lián)比28.8：1)更易于捕獲抗體。同時，通過親和層析法和飽和硫酸銨法純化的抗體經(jīng)間接ELISA法檢測，其效價分別為1:16000和1:32000。雖然相對于抗血清而言，純化抗體的效價有所下降，但SDS-PAGE分析結(jié)果顯示抗體純度有很大的提高。
　　 其次，采用改進(jìn)的Fren

3、s法制備膠體金溶液，操作工藝條件為：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀水浴加熱，將預(yù)熱至80℃的氯金酸加入到檸檬酸三鈉溶液中，最終制備出顆粒均一、單分散的10nm的膠體金溶液并通過透射電鏡和全波長掃描等手段加以鑒定。
　　 最后，通過對樣品墊預(yù)處理液、金標(biāo)墊預(yù)處理液、抗原和抗體包被緩沖液、金標(biāo)稀釋液及金標(biāo)制備工藝等的優(yōu)化和調(diào)試，最終確定鹽酸克倫特羅快檢試紙條的靈敏度為16ng/mL。并經(jīng)時間穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗結(jié)果表明，本研究制備的試紙條可在常溫保存3個