鹽酸克倫特羅抗血清的制備及ELISA檢測(cè)方法的初步建立.pdf

1、為了彌補(bǔ)當(dāng)前市場(chǎng)上鹽酸克倫特羅（CLB）快檢方法所存在的缺陷，尤其是以單克隆抗體為基礎(chǔ)操作周期長(zhǎng)、專業(yè)技術(shù)要求高等不足之處，本實(shí)驗(yàn)利用人工合成抗原BSA-CLB免疫日本大耳白家兔獲得了含鹽酸克倫特羅抗體的抗血清，并對(duì)其進(jìn)行效價(jià)鑒定，在此基礎(chǔ)上初步建立了鹽酸克倫特羅的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法，從而為進(jìn)一步應(yīng)用于市場(chǎng)檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。 首先，本研究采用正交試驗(yàn)方法，利用重氮化反應(yīng)原理將CLB和卵清白蛋白OVA、牛血清白蛋白BSA偶聯(lián)工藝

2、進(jìn)行優(yōu)化，分析了各因素對(duì)偶聯(lián)反應(yīng)的影響機(jī)理，并在得出的最佳條件下合成了高偶聯(lián)率的免疫抗原BSA-CLB和包被抗原OVA-CLB，通過(guò)紫外可見(jiàn)全波長(zhǎng)掃描分析顯示偶聯(lián)前后載體蛋白的吸收峰發(fā)生了很大改變。以經(jīng)過(guò)改進(jìn)的偶聯(lián)率計(jì)算方法計(jì)算得出OVA-CLB和BSA-CLB的偶聯(lián)率分別為29：1和52.3：1。 以免疫抗原BSA-CLB免疫日本大耳白家兔。免疫期間，以O(shè)VA-CLB包被酶標(biāo)板，采用間接非競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血清效價(jià)，并

3、根據(jù)檢測(cè)結(jié)果決定放血時(shí)間。免疫四個(gè)月后，獲得的血清效價(jià)最高達(dá)到1：640000。 最后，本實(shí)驗(yàn)利用免疫所得的抗血清，采用間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法比較不同OVA-CLB包被量、不同抗血清及二抗稀釋度等對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，確立了最佳檢測(cè)條件。并在此條件下根據(jù)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線及靈敏度情況對(duì)檢測(cè)體系的pH值、離子強(qiáng)度、反應(yīng)時(shí)間等進(jìn)行優(yōu)化，最終初步建立了以包被OVA-CLB為基礎(chǔ)的間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)CLB的方法，檢測(cè)靈敏度高達(dá)0.013