斜臥青霉胞外蛋白質(zhì)組學(xué)分析與纖維素酶合成調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、木質(zhì)纖維素是地球上產(chǎn)量巨大而又未得到充分利用的可再生資源。在石油資源日趨枯竭和環(huán)境惡化的嚴(yán)峻形勢下，發(fā)展生物質(zhì)能源，利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)液體燃料和化工產(chǎn)品，不僅可以減緩石油消耗，緩解能源資源緊缺，同時(shí)還可以保護(hù)環(huán)境，促進(jìn)全球經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展。利用微生物產(chǎn)生的纖維素酶分解和轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素是纖維素利用的有效途徑。絲狀真菌所產(chǎn)生的纖維素酶多是胞外酶，便于分離和提取，且所產(chǎn)生的纖維素酶各組分較為齊全，適宜用于工業(yè)化生產(chǎn)。但纖維素酶的效率低、成本高

2、是大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用中的主要瓶頸。對(duì)絲狀真菌纖維素酶酶系組成及其合成調(diào)控機(jī)制的研究對(duì)于提高酶的產(chǎn)量和活性都具有重要的意義。
　　 目前國內(nèi)外對(duì)絲狀真菌纖維素酶的研究主要圍繞木霉和曲霉展開，應(yīng)用基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)等技術(shù)在酶系組成、合成調(diào)控等方面取得了一定進(jìn)展，而對(duì)其它絲狀真菌纖維素酶系組成和合成調(diào)控研究較少，尤其是青霉屬真菌。本論文以實(shí)驗(yàn)室篩選的斜臥青霉為研究對(duì)象，對(duì)其胞外酶系組成進(jìn)行了研究，比較了野生菌株和高產(chǎn)突變菌株在

3、不同培養(yǎng)條件下纖維素降解酶系基因轉(zhuǎn)錄情況和胞外蛋白產(chǎn)生情況，并對(duì)兩個(gè)可能與突變菌株高產(chǎn)性狀相關(guān)的基因進(jìn)行了初步功能分析。這些研究有助于深入認(rèn)識(shí)斜臥青霉的胞外酶系組成和纖維素酶表達(dá)調(diào)控機(jī)制，對(duì)進(jìn)一步開展菌株改造具有一定借鑒意義。
　　 本論文的主要研究結(jié)果如下：
　　 1.克隆了斜臥青霉內(nèi)切葡聚糖酶基因ce15A與ce17B，并在釀酒酵母中進(jìn)行了異源表達(dá)，研究了重組酶的酶學(xué)性質(zhì):采用簡并PCR和TAIL-PCR技術(shù)克隆了斜

4、臥青霉的兩個(gè)內(nèi)切葡聚糖酶基因ce15A和ce17B。ce15A基因全長為1549 bp，含有3個(gè)內(nèi)含子。ce15A cDNA包含一個(gè)長度為1236 bp的開放閱讀框，編碼411個(gè)氨基酸。ce17B基因全長為1425 bp，不含有內(nèi)含子，編碼474個(gè)氨基酸。Southern雜交結(jié)果表明，ce15A和ce17B基因在染色體上均以單拷貝形式存在。熒光實(shí)時(shí)定量PCR轉(zhuǎn)錄分析表明，ce15A和ce17B基因轉(zhuǎn)錄是共調(diào)控的，均受葡萄糖的抑制和纖維素

5、的誘導(dǎo)。構(gòu)建了ce15A和ce17B基因在釀酒酵母中表達(dá)的重組質(zhì)粒，并成功表達(dá)和純化了兩個(gè)重組酶。重組Ce15A和Cel7B最適作用均為60℃，最適作用pH均為4。重組Cel7B降解CMC、大麥β-葡聚糖和磷酸膨脹纖維素的活性分別是Ce15A的8倍、30倍和5倍，但是降解微晶纖維素的能力兩個(gè)酶相差不大，且Ce15A降解微晶纖維素的產(chǎn)物主要為纖維二糖和痕量葡萄糖。這些結(jié)果說明相對(duì)Ce15A，Ce17B是更為嚴(yán)格的內(nèi)切葡聚糖酶。
　　

6、 2.分析了不同碳源對(duì)斜臥青霉野生菌株和突變菌株纖維素酶和半纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄的影響:采用RT-qPCR技術(shù)對(duì)斜臥青霉114-2和JU-A10-S在不同碳源培養(yǎng)條件下的4個(gè)纖維素酶基因(ce17B、ce15A、ce17A、ce16A)和2個(gè)木聚糖酶基因(xyn10A、xyn11A)的轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)這些基因在轉(zhuǎn)錄水平上是共調(diào)控的。微晶纖維素或者微晶纖維素與麥麩對(duì)菌株114-2和JU-A10-S中纖維素酶和半纖維素酶基因的表達(dá)都有

7、很強(qiáng)的誘導(dǎo)作用，且微晶纖維素與麥麩的誘導(dǎo)效果要強(qiáng)于微晶纖維素的誘導(dǎo)效果。乳糖對(duì)菌株114-2中纖維素酶和半纖維素酶基因表達(dá)有很強(qiáng)的誘導(dǎo)作用，但是對(duì)菌株JU-A10-S沒有表現(xiàn)出明顯的誘導(dǎo)作用，可能與乳糖的轉(zhuǎn)運(yùn)或者代謝途徑受到了破壞有關(guān)。山梨糖對(duì)菌株JU-A10-S中纖維素酶和半纖維素酶基因表達(dá)有很強(qiáng)的誘導(dǎo)作用，但是對(duì)菌株114-2沒有表現(xiàn)出明顯的誘導(dǎo)作用，可能與山梨糖的代謝速率無關(guān)，而是由其它突變引起的。菌株JU-A10-S在葡萄糖培養(yǎng)

8、條件下，纖維素酶和半纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄水平要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于菌株114-2中各基因轉(zhuǎn)錄水平，表現(xiàn)出顯著的抗降解物阻遏。菌株JU-A10-S在所有培養(yǎng)條件下，纖維素酶和半纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄水平都要高于菌株114-2中各基因轉(zhuǎn)錄水平，可能與creA的移碼突變部分有關(guān)。
　　 3.利用雙向熒光差異凝膠電泳技術(shù)(2D-DIGE):研究了斜臥青霉胞外酶系組成，并對(duì)野生菌株與突變高產(chǎn)菌株在不同培養(yǎng)條件下的胞外差異蛋白進(jìn)行了分析利用雙向熒光差異凝膠電泳技

9、術(shù)(2D-DIGE)對(duì)斜臥青霉野生菌株114-2與突變高產(chǎn)菌株JU-A10-T在葡萄糖、微晶纖維素.麥麩培養(yǎng)條件下的胞外蛋白進(jìn)行了分析。成功鑒定出了38種蛋白，其中大部分蛋白為生物質(zhì)降解酶類，參與纖維素、半纖維素、淀粉、蛋白質(zhì)、果膠、幾丁質(zhì)等的降解。野生菌株114-2在葡萄糖培養(yǎng)條件下，鑒定到3種基礎(chǔ)性表達(dá)纖維素酶，并鑒定到含量較高的淀粉酶、果膠酶和蛋白酶PepA。野生菌株114-2在微晶纖維素-麥麩培養(yǎng)條件下，胞外纖維素酶和半纖維酶的

10、種類和含量都在增加，但并未檢測到果膠酶，顯示果膠酶與(半)纖維素酶的合成分別屬于不同的調(diào)控體系。此外，在胞外還檢測到了含量較高的蛋白酶PepB，而并沒有檢測到蛋白酶PepA，顯示這兩種蛋白酶的合成受培養(yǎng)條件的影響。突變菌株JU-A10-T在葡萄糖培養(yǎng)條件下，表現(xiàn)出明顯的抗降解物阻遏特性，胞外纖維素酶和半纖維素酶含量明顯上調(diào)，并出現(xiàn)更多種類的纖維素酶和半纖維素酶，但淀粉酶的合成受到了抑制。突變菌株JU-A10-T在微晶纖維素-麥麩培養(yǎng)條件

11、下，表現(xiàn)出明顯的超誘導(dǎo)，胞外蛋白濃度、纖維素酶活和木聚糖酶活大幅度提高；胞外蛋白中幾種纖維素酶和半纖維素酶組分含量明顯上調(diào)，而其它纖維素酶和半纖維素酶的含量則幾乎都下調(diào)，顯示木質(zhì)纖維素降解酶受到的調(diào)控之間存在部分差異；另外只檢測到痕量淀粉酶并且未檢測到蛋白酶，顯示突變株中相關(guān)調(diào)控系統(tǒng)發(fā)生了重要變異。
　　 4.敲除了斜臥青霉α-甘露糖苷酶基因和絲氨酸蛋白激酶基因，對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行了初步研究。利用融合PCR和巢式PCR方法構(gòu)建了

12、α-1，2-甘露糖苷酶基因(mnsl)和絲氨酸蛋白激酶基因(pkl)敲除盒，并利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法，成功敲除了斜臥青霉KU-39 mnsl基因和pkl基因。α-1，2-甘露糖苷酶基因(mnsl)和絲氨酸蛋白激酶基因(pkl)的敲除對(duì)菌株的菌落大小、孢子顏色、孢子形態(tài)、菌絲直徑均沒有影響。α-1，2-甘露糖苷酶基因(mnsl)的敲除，提高了胞外蛋白濃度和纖維素酶活力，猜測其可能參與了未正確折疊蛋白的清除。絲氨酸蛋白激酶基因(pkl)的敲