高效纖維素分解菌Aspergillus fumigatus Z5的產(chǎn)酶研究與胞外蛋白組學(xué)分析.pdf

1、當(dāng)前世界能源、資源以及環(huán)境問題日趨嚴(yán)重，人類經(jīng)過長期的研究希望利用纖維素酶將地球上最豐富、最廉價的植物纖維轉(zhuǎn)化為能被人類使用的能源和資源。隨著纖維素酶需求量的增加，高效的纖維素分解菌以及纖維素酶的獲得已經(jīng)成為世界各國微生物界研究的熱點，特別是在堆肥和生物能源領(lǐng)域的研究。纖維素的分解是堆肥過程或纖維素工業(yè)利用中最重要的步驟之一，其過程主要由微生物分泌的纖維素酶來完成。纖維素酶是指能夠水解纖維素及其衍生物的一系列酶的總稱，主要包括內(nèi)切葡聚糖

2、酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶，它們相互協(xié)作來分解纖維素。
　　 采用結(jié)晶纖維素唯一碳源法從不同的堆肥樣品中分離篩選到了一株高效的纖維素分解真菌Z5，結(jié)合菌株形態(tài)特征和ITS序列分析將其鑒定為煙曲霉（Aspergillusfumigatus Z5）。利用不同的底物在固體發(fā)酵條件下誘導(dǎo)菌株產(chǎn)酶，通過測定纖維素酶活力來評價菌株Z5纖維素分解能力。在固體發(fā)酵下優(yōu)化了菌株Z5的產(chǎn)酶條件，結(jié)果表明菌株的最佳產(chǎn)酶條件為50℃培養(yǎng)、80％起

3、始含水率、起始pH4.0以及7％的接種量，在該條件下內(nèi)切葡聚糖酶活力和濾紙酶活力分別為526.3和144.6 U·g-1干重，該結(jié)果比已報道同屬的大部分菌株的活力都要高。菌株分泌的粗酶的最佳催化溫度和最佳催化pH分別為50℃和pH5.0;粗酶的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性研究結(jié)果表明，在70℃條件下保持20h后，其相對酶活力為37.8％，在pH5.0的緩沖體系中，粗酶的相對酶活力保持在95％以上的水平。菌株Z5分泌的粗酶的酶譜分析結(jié)果表明，在含

4、有羧甲基纖維素的丙烯酰胺膠里面能夠檢測到8條明顯有內(nèi)切葡聚糖酶活力的條帶。將菌株Z5分泌的粗酶對玉米芯進行糖化實驗并利用釀酒酵母進行產(chǎn)生物酒精實驗，結(jié)果表明生物酒精的產(chǎn)量比較可觀，達(dá)到0.112 g·g-1干重(gDS)。
　　 分別以葡萄糖、結(jié)晶纖維以及稻草粉為唯一碳源誘導(dǎo)菌株Z5進行液體產(chǎn)酶，并測定了纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶的活力。結(jié)果表明，以稻草秸稈粉為唯一碳源誘導(dǎo)條件下，內(nèi)切葡聚糖酶活力第四天達(dá)到最大值(12.17

5、U·ml-1)、濾紙酶活力第五天達(dá)到最大值(1.71 U·ml-1);外切葡聚糖酶活力不斷的升高，并在結(jié)束培養(yǎng)時達(dá)到最大值(0.58 U·ml-1);β-葡萄糖苷酶酶活力第四天達(dá)到了最大值(2.49 U·m1-1)、木聚糖酶活力二天后達(dá)到最大值(181.87 U·ml-1)、海帶多糖酶活力兩天后達(dá)到最大值(2.37U·ml-1)、地衣多糖酶活力三天后達(dá)到最大值(12.78 U·ml-1);利用iTRAQ技術(shù)鑒定并定量出了54個蛋白，根據(jù)

6、其功能的不同將其分成了不同的類型，其中纖維素酶占21％、半纖維素酶占8％、糖苷水解酶占11％、幾丁質(zhì)酶占5％、木質(zhì)素酶類占2％、磷酸酯酶占3％、轉(zhuǎn)運蛋白占3％，蛋白酶占5％、淀粉酶占2％、脂肪酶占2％、果膠酶占2％、氧化還原酶占6％，域蛋白占3％、其他類占13％、而未知蛋白占了14％。這些鑒定的蛋白的理論分子量分布在180-10kDa之間，但是大部分蛋白的分子量主要聚集在80-20kDa;鑒定蛋白的預(yù)測等電點分布在4.5-9.5之間，而

7、pI4.5-6.5之間的蛋白數(shù)量居多。
　　 通過簡并引物并結(jié)合hiTail-PCR的方法從菌株Z5中克隆到了兩個纖維素酶基因agl2和egl3，并在畢赤酵母X33中成功表達(dá)。兩個基因預(yù)測的氨基酸序列分析結(jié)果表明，兩個基因都和糖基水解酶第五家族的酶有很高的相似性。SDS-PAGE和WesternBlot分析結(jié)果表明，兩個基因都已經(jīng)獲得了功能表達(dá)，而酶譜分析結(jié)果顯示兩個重組內(nèi)切葡聚糖酶Egl2和Egl3都有內(nèi)切葡聚糖酶活力。兩個重

8、組內(nèi)切葡聚糖酶的酶學(xué)特性研究表明，Egl2的最佳pH條件為5.0，而Egl3的最佳pH為4.0; Egl2的最佳催化溫度為50℃，而Egl3的最佳催化溫度為60℃;兩個內(nèi)切葡聚糖酶都具有良好的熱穩(wěn)定性，在40-60℃的溫度范圍和pH4-7范圍內(nèi)都能夠保持較高的相對酶活力。分別在Egl2和Egl3的最佳催化條件下，以羧甲基纖維素為底物測定了兩個重組酶的Km和Vmax值，結(jié)果表明Egl3的催化效率要高于Egl2。通過薄層層析的方法分析了兩個

9、重組酶對不同纖維二糖的水解效率，結(jié)果表明，Egl2可以催化分解纖維四糖和五糖而不能催化分解纖維二糖和三糖，而Egl3除了纖維二糖外都可以催化分解。
　　 利用離子交換層析、分子篩和親和層析的方法，從菌株Z5分泌的粗酶液中分離到了一個電泳純的β-葡萄糖苷酶nBgl3。利用LC-MS/MS的方法檢測了nBgl3的內(nèi)部氨基酸序列，通過NCBI的比對分析獲得了比較保守的氨基酸序列，在此基礎(chǔ)上通過PCR方法獲得了編碼該酶的基因?；虻膲A基

10、序列分析表明，bgl3包含了一個2622bp的完整閱讀框，該基因編碼的蛋白的預(yù)測分子量為91.47kDa; bgl3預(yù)測的氨基酸序列的比對分析表明該基因是糖基水解酶第三家族成員。通過構(gòu)建酵母表達(dá)載體，將bgl3在畢赤酵母X33中成功表達(dá)，并獲得了一個重組β-葡萄糖苷酶rBgl3;活性膠電泳分析結(jié)果表明rBgl3具有β-葡萄糖苷酶活力，能夠在含有pNPG的活性膠內(nèi)檢測到熒光條帶。兩個重組純化的β-葡萄糖苷酶酶學(xué)特性分析結(jié)果表明，nBgl3

11、和rBgl3在60℃和pH6的條件下都具有最佳的催化效率，而在50-70℃和pH4-7的范圍內(nèi)兩個β-葡萄糖苷酶都有較好的穩(wěn)定性。本研究分析了兩個β-葡萄糖苷酶的nBgl3和rBgl3不同底物的比酶活力，結(jié)果表明兩個酶對底物pNPG有最大的比酶活力，分別為103.5和101.7U·mg-1，但是兩個酶對羧甲基纖維素、乳糖、木聚糖幾乎沒有催化活力。
　　 綜上，本論文利用結(jié)晶纖維素唯一碳源法，從堆肥高溫層樣品中分離篩選到了一株高效