可高效降解雌激素的惡臭假單胞菌SJTE-1降解性質與蛋白組學研究.pdf

1、環(huán)境內分泌干擾物污染，尤其是環(huán)境雌激素類污染物（Environmental Estrogens）污染，因其對人類健康的影響最廣，危害最大，被認為是繼“溫室效應”和“臭氧層破壞”之后的又一嚴重的全球性環(huán)境公害問題。因其種類多，分布廣，難降解，環(huán)境存留期長，且會通過食物鏈逐級累積放大，具有很強的致癌、致畸與致病性，直接威脅著人類社會與生物圈的生存與繁衍。17β-雌二醇作為天然雌激素類污染物的主要成員，對生物體具有很大的危害。因此如何治理環(huán)境

2、中雌激素物質的污染、降低其危害已被列為環(huán)境治理與預防醫(yī)學領域的研究重點。近年來，微生物降解因其降解效率高和無二次污染等優(yōu)勢，被認為是去除環(huán)境雌激素的主要與有效手段。從環(huán)境中分離獲得的微生物菌株或菌群，可利用雌激素類物質作為碳源或營養(yǎng)物質，經(jīng)過復雜的生理代謝，最終將其完全分解為無害的終產(chǎn)物。目前已有多種菌株被證實具有雌激素降解能力，但是由于降解效率不理想，遺傳背景不確定，基因組信息缺乏，代謝機制不清晰，直接限制了微生物修復雌激素污染的進程

3、。
　　本課題圍繞我們從污水處理廠活性污泥中富集分離的一株可利用雌激素類物質的微生物菌株SJTE-1開展，從其理化性質與進化地位、雌激素降解利用效能、全基因組序列與比較蛋白組學幾個方面進行了研究：確定了菌株 SJTE-1的進化地位，檢測了其利用17β-雌二醇（E2）生長的性質及其降解效能；利用GLX-454平臺和Illuminia測序平臺，測定了該菌株的全基因組序列并進行了比對分析，預測了一系列可能參與雌激素降解的基因；利用同位素

4、相對標記與絕對定量技術（iTRAQ技術），測定了菌株SJTE-1在17β-雌二醇環(huán)境下和營養(yǎng)豐富條件下的蛋白組學，并進行了比較與分析。最后，利用Tn轉座子突變技術，對該菌株進行了隨機突變與篩選。主要內容如下：
　　1.菌株SJTE-1的分離鑒定與雌激素降解效能分析
　　利用17β-雌二醇富集培養(yǎng)分離獲得的菌株SJTE-1，理化性質分析顯示其為革蘭氏陰性菌，菌落質地柔軟，扁平，乳白色，半透明，表面光滑而有光澤度，邊緣呈圓形，且

5、散發(fā)出濃烈的腥臭味；最適生長溫度為30?C。16S rRNA基因擴增測序比對結果表明，菌株SJTE-1與假單胞菌屬（Pseudomonas）的16S rRNA基因序列具有極高的同源性與相似性（>99％）；系統(tǒng)進化樹比對結果證實其與惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）的遺傳距離最近，為惡臭假單胞菌。
　　利用全自動生長曲線測定儀，對菌株SJTE-1以不同濃度的17β-雌二醇為單一碳源生長的情況進行實時監(jiān)測。生長曲線結

6、果顯示，菌株SJTE-1可耐受和利用高達100 mg/L的17β-雌二醇，其生物量與雌激素濃度呈現(xiàn)正相關，雌激素濃度增加會延長細菌生長的平臺期。之后，我們利用超高效液相色譜技術測定了菌株降解不同濃度雌二醇的降解效率，結果表明24小時內菌株SJTE-1可將1 mg/L的17β-雌二醇完全降解；七天內該菌株可完全分解高達25.0 mg/L的E2，對100 mg/L的17β-雌二醇降解效率也可達80%以上，遠遠高于已報道的其它菌株的效能。進一

7、步對其代謝產(chǎn)物的分析顯示，17β-雌二醇首先被菌株SJTE-1分解成為雌酮（E1）后，再被其降解為無雌激素活性的終產(chǎn)物。因此，菌株SJTE-1具有很高的雌激素降解效能與雌激素耐受性，降解周期短，降解產(chǎn)物無二次污染，可作為環(huán)境生物修復的候選菌株。
　　2.惡臭假單胞菌SJTE-1全基因組序列測定與分析
　　利用GLX-454平臺和Illuminia測序平臺，我們測定并分析了惡臭假單胞菌SJTE-1的全基因組序列。菌株SJTE-

8、1的基因組總長5,551,505 bp，GC含量為62.25%，含有4,915個編碼基因，1個16S-23S-5S操縱子，52個 tRNA；其編碼的蛋白功能涉及到各個代謝途徑，包括跨膜轉運，脅迫反應，核酸代謝，蛋白代謝，芳香族化合物代謝，輔因子等。序列比對與預測結果顯示，菌株SJTE-1的基因組中包含多個可能編碼激素分解酶的同源基因，包括短鏈脫氫/還原酶，乙酰輔酶A脫氫酶，烯?；?酰載體蛋白還原酶，3-氧?；?酰基載體蛋白還原酶等，這些

9、基因可能與雌二醇的降解直接相關。因此，全基因組序列的測定與分析的完成明確了菌株 SJTE-1的遺傳信息，將有助于推進其降解基因與降解機制研究。
　　3.惡臭假單胞菌SJTE-1比較蛋白質組學研究
　　蛋白質組學通過測定不同條件下細胞內蛋白的表達水平，可確定細胞整體的代謝機制變化。在惡臭假單胞菌SJTE-1的全基因組序列測定完成后，利用iTRAQ技術，我們對菌株SJTE-1在17β-雌二醇為單一碳源培養(yǎng)條件下的整體蛋白表達情況

10、進行了定性與定量分析，并與其在葡糖糖培養(yǎng)條件下的蛋白表達情況進行了比較。結果表明，在17β-雌二醇培養(yǎng)條件下，有78個蛋白表現(xiàn)出有顯著差異（p<0.05），其中45個蛋白明顯上調，33個蛋白發(fā)生了明顯下調。這些差異表達蛋白涉及脅迫回應，碳源攝取，胞內轉運，能量代謝，核酸代謝及轉錄翻譯等過程。表達上調的蛋白多集中在對碳源的攝取與胞內轉運，相關核糖體蛋白的表達及能量代謝相關蛋白；而表達下調的蛋白多與葡萄糖識別及其代謝相關。這說明菌株SJTE

11、-1在以17β-雌二醇為碳源生長時，會相應提高與之相關的代謝途徑及能量需求。因此，這一比較蛋白質組學結果初步明晰了菌株SJTE-1代謝雌激素的整體網(wǎng)絡，為后續(xù)降解關鍵基因與調控基因的鑒定指明了方向。
　　4. Tn5轉座子隨機突變
　　為了確定參與雌激素降解的基因，我們利用Tn5轉座子隨機突變方法對惡臭假單胞菌SJTE-1進行突變，根據(jù)其雌激素降解效能缺失與抗生素抗性情況進行篩選。共篩選獲得了56株突變株，它們可在豐富培養(yǎng)基

12、中正常生長，但不能在以雌二醇為單一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中生長，說明這些突變株的雌二醇降解能力受影響，Tn5插入的基因可能是參與雌二醇分解的關鍵基因。但對Tn5插入位點的反向測序結果未發(fā)現(xiàn)有效的基因信息，即其序列與已報道的雌激素降解基因或組學方法預測的潛在降解基因之間無重疊。后續(xù)我們將對突變株進行全基因組掃描來確定其Tn插入位點，最終確定菌株SJTE-1中雌激素降解的關鍵基因。
　　綜上所述，本課題富集分離了一株新的具有實際應用潛能的

13、環(huán)境雌激素降解菌株SJTE-1，利用分子生物學技術和組學技術，對其降解效能、全基因組學和比較蛋白組學進行了研究，并對其降解分子機制進行了初探。結果顯示惡臭假單胞菌SJTE-1可耐受高濃度雌二醇，降解效率高，降解周期短；其基因組中包含了多個潛在的雌激素降解基因，在雌二醇為單一碳源環(huán)境下，菌株SJTE-1胞內的多個涉及到脅迫回應，碳源攝取，胞內轉運，能量代謝，核酸代謝及轉錄翻譯等過程的蛋白的表達水平均發(fā)生了顯著性變化。本課題的完成將有助于推