產(chǎn)堿假單胞菌降解地塞米松相關(guān)蛋白酶的研究.pdf

1、目的：本文在從醫(yī)院廢水中分離到一株可降解地塞米松磷酸鈉和地塞米松的產(chǎn)堿假單胞菌的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分離提取與該菌降解有關(guān)的蛋白酶，并探討其特性，為制備清除環(huán)境中地塞米松類藥物污染的生物凈化劑奠定基礎(chǔ)。
　　方法：將分離的降解地塞米松的產(chǎn)堿假單胞菌在地塞米松磷酸鈉培養(yǎng)液長期反復(fù)培養(yǎng)訓(xùn)化，以提高該菌對地塞米松的降解率。再用滲透休克法提取該菌的胞外蛋白、周質(zhì)蛋白和胞內(nèi)蛋白，SDS-PAGE電泳分析提取的各部位蛋白，對主要蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。用

2、高效液相色譜法（HPLC）檢測各部位蛋白的降解酶活性，以確定降解酶存在的部位。對具有酶活性的胞內(nèi)蛋白先用硫酸銨鹽析，再用離子交換層析與葡聚糖凝膠層析相結(jié)合的方法進(jìn)一步提取純化。用HPLC法檢測在純化過程中蛋白酶的降解活性，用BCA法檢測蛋白濃度，再計算出比活力，純化倍數(shù)及回收率。將純化后的蛋白酶切后質(zhì)譜鑒定，并測定其降解反應(yīng)的動力學(xué)特征。
　　結(jié)果：地塞米松降解菌經(jīng)多次馴化后，對地塞米松磷酸鈉的降解率從馴化前的50.89％提高到7

3、5.7%，將地塞米松降解為其它物質(zhì)的降解率從23.63%提高到74.99%。馴化菌在馴化前后對地塞米松磷酸鈉與地塞米松的降解有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。在常規(guī)培養(yǎng)條件下對地塞米松磷酸鈉與地塞米松也有顯著的降解作用。從馴化菌提取到分子量約為100kDa，41kDa及20kDa三種主要蛋白質(zhì)，質(zhì)譜鑒定分別與TonB依賴性受體蛋白，異戊酰輔酶A脫氫酶和假定蛋白有較高的相似性。馴化菌的胞內(nèi)蛋白具有較高的降解酶活性。從胞內(nèi)蛋白中提取純化到

4、41kDa蛋白，質(zhì)譜鑒定與異戊酰輔酶 A脫氫酶有較高的相似性。降解酶在溫度25℃-40℃和pH6.5-pH8.5條件下具有較好的降解作用，酶促反應(yīng)動力學(xué)方程為Ct=C0 e-0.1769t，符合一級動力學(xué)方程。
　　結(jié)論：本文成功馴化了所分離的地塞米松降解菌，明確了降解酶所存在的部位。成功提取了馴化菌的主要蛋白，明確了這些蛋白的性質(zhì)。提取純化了胞內(nèi)蛋白中的降解酶，了解了酶蛋白的降解特性，構(gòu)建了酶促反應(yīng)動力學(xué)方程。為進(jìn)一步制備清除環(huán)