產(chǎn)堿假單胞菌脂肪酶分子改造及拆分制備l-薄荷醇的研究.pdf

1、l-薄荷醇是一種重要的手性化合物，具有特別的薄荷香氣和強烈的清涼作用，氣味新鮮輕快，同時它還具有興奮鎮(zhèn)痛、殺菌止癢、促滲透、助消化等功效，因此具有很高的工業(yè)和醫(yī)藥應用價值。由于天然提取的l-薄荷醇的品質(zhì)易受各種因素的影響且近年來市場需求越來越大，天然來源的l-薄荷醇已不再滿足日益增長的需求。采用生物催化的方法獲得l-薄荷醇正逐漸成為研究的熱點。
　　本文在前期篩選得到一株產(chǎn)堿假單胞菌(PseudomonasalcaligenesC

2、GMCC4405)，能夠產(chǎn)生對四對外消旋薄荷醇丙酸酯進行選擇性水解的脂肪酶(PaL)。在此基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建基因文庫對PaL的基因進行了克隆和異源表達。對重組PaL進行了表達純化測定其精確分子量為58094.3Da。通過肽指紋圖譜驗證了由DNa序列推測得到的氨基酸序列的準確性。遠紫外區(qū)圓二色譜結(jié)果表明PaL含有26.8％的α螺旋，34.2％的β折疊，14.2％的轉(zhuǎn)角和24.7％無規(guī)卷曲。PaL拆分四對外消旋薄荷醇丙酸酯具有較好的對映體選擇

3、性，其E＞200。但其非對映體選擇性有待于進一步提高。搖瓶發(fā)酵脂肪酶PaL的酶活為4625U/L。最適溫度為35℃，最適pH為9.0。在pH6.5-10.0之間都有較好的穩(wěn)定性，但熱穩(wěn)定性相對較差。
　　針對PaL具有非常好的對映體選擇性這一問題，我們研究了PaL的對映體識別機理。通過對酶-底物復合物結(jié)構(gòu)進行分析發(fā)現(xiàn):當脂肪酶PaL與d-薄荷醇丙酸酯結(jié)合時，位于R構(gòu)型的手性中心C2上的異丙基的取向朝向催化組氨酸His271。異丙基

4、的空間位阻迫使催化組氨酸His271的咪唑環(huán)偏轉(zhuǎn)了約30°。這一偏轉(zhuǎn)直接導致了Hε(His271)與O(alcohol)之間距離由2.2(A)拉大到3.7(A)，進而使得這兩個原子之間的必須氫鍵無法形成。從而最終導致了d-薄荷醇丙酸酯與脂肪酶PaL形成的酶-底物復合物不夠穩(wěn)定，與l-薄荷醇丙酸酯相比無法正常水解。這可能是脂肪酶PaL具有很好對映體選擇性的根本結(jié)構(gòu)原因
　　通過底物分子共價對接技術(shù)研究了l-薄荷醇丙酸酯和非目標底物與

5、PaL的結(jié)合方式，并以此為指導構(gòu)建了突變蛋白V180L/A272F。突變型PaL催化的水解產(chǎn)物中l(wèi)-薄荷醇對l-新薄荷醇的非對映體比率由野生型的6.6∶1提高到30.7∶1。而對d-新異薄荷醇的非對映體比率則由12.0∶1提高到25.5∶1。分子動力學模擬表明定點突變在特定位置引入了較大的空間位阻效應，限制了底物手性中心上所連基團的空間取向，同時突變位點附近區(qū)域增大的結(jié)構(gòu)剛性鞏固了由空間位阻引起的限制作用從而最終強化了PaL對不同構(gòu)型底

6、物的分子識別，提高了非對映體選擇性。
　　為進一步提高非對映體選擇性，我們采用了定點突變結(jié)合體外化學修飾的方法。首先構(gòu)建突變體A272C，引入了化學修飾的特異性靶點。然后使用DTNB對半胱氨酸進行特異性修飾，獲得了Q272C-DTNB修飾脂肪酶。MQLDI-TOFmass驗證了DTNB的有效修飾。遠紫外區(qū)和近紫外區(qū)圓二色譜結(jié)果表明DTNB的修飾沒有引起PaL二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的明顯變化。綜合拆分實驗結(jié)果和分子動力學模擬結(jié)果發(fā)現(xiàn):由

7、DTNB的化學修飾引入了較大的空間位阻相應和降低了PaL修飾位點附近區(qū)域結(jié)構(gòu)柔性，使得脂肪酶對非目標底物的Km值有了較大幅度的提高。這種區(qū)域結(jié)構(gòu)柔性與非目標底物Km值的相關(guān)性可以解釋為由DTNB的化學修飾所引起的增大的局部空間位阻效應和降低的區(qū)域結(jié)構(gòu)柔性阻礙了非目標底物的誘導契合過程，從而降低了Q272C-DTNB修飾脂肪酶對非目標底物的親和性，提高了非目標底物的Km值，從而最終導致了化學修飾脂肪酶的非對映體選擇性的進一步提高。

8、　　為實現(xiàn)PaL的高效制備，我們研究了重組E.coli的高密度發(fā)酵技術(shù)。分批發(fā)酵階段研究確定了葡萄糖對細胞干重的得率系數(shù)YX/S=0.7，同時研究確定了20℃為最有利于重組脂肪酶誘導表達的溫度。在補料發(fā)酵階段，我們發(fā)現(xiàn)控制比生長速率μ=0.21h-1時對細胞的生長和積累最為有利。此時，乙酸濃度可以控制在較低水平，同時葡萄糖也不存在積累現(xiàn)象。所得最大細胞干重在70g/L左右。誘導時機的研究結(jié)果表明第15小時開始誘導，IPTG加入量為20μ

9、mol/g干菌體最為合適。重組脂肪酶發(fā)酵游離酶活為200000U/L左右。全細胞酶活為20000U/L。SDS-PQGE電泳結(jié)果表明重組脂肪酶以可溶性表達為主，基本沒有包涵體形成。
　　在前面實現(xiàn)高密度發(fā)酵的基礎(chǔ)上，使用重組E.coli全細胞對四對外消旋薄荷醇進行拆分。研究確定了轉(zhuǎn)化溫度為30℃。隨后研究了重組E.coli全細胞的底物和產(chǎn)物抑制情況。對對拆分反應有顯著影響的催化劑載量、底物濃度和助溶劑加量進行了優(yōu)化。確定最優(yōu)催化劑