洋蔥布克氏菌(Burkholderia cepacia)酯酶酶法不對(duì)稱拆分dl-薄荷醇研究.pdf

1、天然薄荷醇由于受天氣和地域等的影響，產(chǎn)量和質(zhì)量波動(dòng)很大，近年來，利用生物法拆分dl-薄荷醇制備l-薄荷醇已經(jīng)成為l-薄荷醇生產(chǎn)的研究熱點(diǎn)。本文利用透明圈平板初篩與轉(zhuǎn)化反應(yīng)氣相檢測(cè)復(fù)篩相結(jié)合的方法，篩選出了一株具有高度不對(duì)稱水解dl-乙酸薄荷酯生成l-薄荷醇的菌株Burkholderia cepacia；以此菌株為材料，對(duì)其培養(yǎng)條件，整細(xì)胞體系的轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了詳細(xì)研究；并對(duì)該菌株細(xì)胞中立體選擇性酯酶同工酶進(jìn)行了分離純化，研究了其酶學(xué)性質(zhì)，

2、為其進(jìn)一步克隆表達(dá)和相關(guān)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。主要工作包括：
　　 1)以提高單位發(fā)酵液中的酶活為目標(biāo)，選擇菌體生長和產(chǎn)酶為指標(biāo)，利用響應(yīng)面法對(duì)B.cepacia的培養(yǎng)條件和營養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶的最優(yōu)培養(yǎng)基組成為：葡萄糖2.27%，牛肉膏1.58%，蛋白胨1.83%，K2HPO40.42%，MgSO4·7H2O0.02%，CaCl20.01%，NaCl0.5%；較優(yōu)環(huán)境條件為：接種量6%，培養(yǎng)溫度30℃，裝液量15%

3、，初始pH值為7.0～7.5，培養(yǎng)時(shí)間為48 h；在此最優(yōu)條件下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶，產(chǎn)酶量比未優(yōu)化時(shí)提高了2.3倍。
　　 2)采用硫銨鹽析、疏水層析、離子交換層析和凝膠過濾對(duì)B.cepacia的胞內(nèi)酯酶進(jìn)行了分離純化。同工酶Estl的比酶活提高了近3倍，為0.77 U/mg，分子量為66 kDa；同工酶Est2的比酶活提高了近23倍，為5.91 U/mg，分子量約為37 kDa。Est1和Est2的最適pH都為7.0，最適反應(yīng)溫

4、度為30℃，活性中心都存在絲氨酸殘基，且都不屬于金屬酶類。立體選擇性受溫度影響不明顯，但受pH影響嚴(yán)重，pH過高或過低都會(huì)引起立體選擇性的明顯下降，添加大部分表面活性劑或抑制劑均使酶的立體選擇性下降。Est1沒有明顯位置特異性，而Est2具有2-位特異性，它們都優(yōu)先水解短鏈脂肪酸酯。除甲酸薄荷酯外，均優(yōu)選短鏈l-型脂肪酸薄荷酯進(jìn)行水解。因此，兩目的酶都屬于短鏈酯酶。Est1的N-末端氨基酸組成為：MHITTT，Est2的N-末端氨基酸組

5、成為：MGARTDA，與已知Burkholderia sp.水解酶(酯酶/脂肪酶)均沒有明顯的同源性，說明Est1和Est2都可能是一種新酶，都屬于羧酸酯酶大類(EC3.1.1.1)。
　　 3)對(duì)B.cepacia整細(xì)胞催化的dl-乙酸薄荷酯不對(duì)稱水解制備l-薄荷醇的生物催化過程進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)添加助溶劑可改變底物與酶的接觸面積和整細(xì)胞的通透性，從而對(duì)催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物ee值(對(duì)映體過剩量)有一定的影響，添加15%的二甲亞砜