洋蔥假單胞菌脂肪酶在非水相介質(zhì)中構(gòu)效關(guān)系的研究.pdf

1、與化學(xué)催化劑相比,脂肪酶催化劑具有反應(yīng)條件溫和、催化效率高、過程能耗低和環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn),但制備成本相對較高,且易失活和穩(wěn)定性差,上述不足嚴(yán)重制約了脂肪酶的工業(yè)化應(yīng)用。為解決這些問題,國內(nèi)外學(xué)者嘗試通過溶劑工程和蛋白質(zhì)工程等方法提高脂肪酶的活性和穩(wěn)定性,從而降低催化反應(yīng)的生產(chǎn)成本。洋蔥假單胞菌脂肪酶(PCL)被廣泛應(yīng)用于有機(jī)相催化反應(yīng),但其在非水相介質(zhì)中的活力變化機(jī)制尚未完全清楚。本文以脂肪酶PCL為對象,通過溶劑工程的手段,詳細(xì)研究了5

2、種有機(jī)溶劑、19種離子液體和高壓CO2對脂肪酶活力和結(jié)構(gòu)的影響,篩選出了適合脂肪酶PCL催化的最適反應(yīng)介質(zhì),并初步闡釋了脂肪酶PCL在非水相介質(zhì)中活力變化的內(nèi)在機(jī)制;為脂肪酶PCL的生產(chǎn)應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。主要研究內(nèi)容和結(jié)果摘要如下:
　　1.有機(jī)溶劑對脂肪酶PCL活力和結(jié)構(gòu)的影響。研究了脂肪酶PCL在有機(jī)溶劑體系中的催化反應(yīng),40°C搖床反應(yīng)12h后氣相色譜分析生物柴油得率。結(jié)果表明,生物柴油得率隨有機(jī)溶劑logP的增

3、加而降低,即脂肪酶PCL在親水性有機(jī)溶劑(叔戊醇和叔丁醇)中有較高生物柴油得率,而在疏水性有機(jī)溶劑(石油醚、正己烷和異辛烷)中則表現(xiàn)出較低活力,可能是由于反應(yīng)底物與產(chǎn)物在親水性有機(jī)溶劑中能夠形成均一反應(yīng)體系,增加了底物與酶的接觸機(jī)率,并降低了反應(yīng)底物甲醇和反應(yīng)產(chǎn)物甘油對脂肪酶的毒害作用。紅外光譜分析表明,有機(jī)溶劑對脂肪酶PCL的二級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了不同程度的影響,且脂肪酶PCL活力的增加可能是由于α-螺旋含量的降低導(dǎo)致酶的活性中心暴露、從而使

4、酶更容易與底物接觸的緣故。熒光光譜分析表明,有機(jī)溶劑使脂肪酶PCL的三級結(jié)構(gòu)也發(fā)生了變化,且蛋白質(zhì)熒光強(qiáng)度的增加與其活力的提高成正比關(guān)系。
　　2.離子液體對脂肪酶PCL活力和結(jié)構(gòu)的影響。研究了脂肪酶PCL在離子液體中的活力變化,反應(yīng)底物大豆油和甲醇在40°C反應(yīng)12h后,GC分析生物柴油得率。結(jié)果表明,陰離子對脂肪酶活力影響的差異性遠(yuǎn)大于陽離子,含有疏水性陰離子[PF6]–和[Tf2N]–的離子液體適合作為反應(yīng)溶劑,脂肪酶PCL

5、在兩性離子液體[Ompy][BF4]中得到最高生物柴油得率為82.3％;而脂肪酶在親水性和親核性離子液體中則表現(xiàn)出較低的催化活力,可能是由于親水性離子液體影響了脂肪酶微環(huán)境中必需水的含量,導(dǎo)致脂肪酶的空間構(gòu)象發(fā)生了變化,而親核性離子液體則易吸附在脂肪酶活性中心附近,從而阻礙了催化中心與底物的結(jié)合。紅外光譜分析表明,脂肪酶PCL的二級結(jié)構(gòu)在離子液體中發(fā)生了不同程度的變化,而脂肪酶PCL活力的增加可能是α-螺旋含量的降低使蛋白質(zhì)的活性中心暴

6、露,從而使底物更容易進(jìn)入。
　　3.高壓CO2對液體脂肪酶PCL催化特性的影響。研究了液體脂肪酶PCL在高壓CO2中活力、結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的變化,以橄欖油為反應(yīng)底物,測定了高壓處理脂肪酶PCL的水解活力。實(shí)驗結(jié)果表明,壓力和溫度的增加顯著提高了液體脂肪酶的水解活力,可能是由于高壓CO2與脂肪酶的相互作用使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化所致。反應(yīng)動力學(xué)表明,高壓處理提高了液體脂肪酶PCL的最大反應(yīng)速度Vmax,降低反應(yīng)的活化能Ea,但顯著降低了對

7、底物的親和力和催化效率,蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性和對親水性有機(jī)溶劑的耐受性也顯著性降低。SDS-PAGE表明,高壓處理沒有使蛋白質(zhì)發(fā)生聚集或斷裂,說明高壓CO2對液體脂肪酶的一級結(jié)構(gòu)未產(chǎn)生影響。圓二色和熒光光譜分析表明,6MPa/35°C處理液體脂肪酶PCL的活力變化主要是由于高壓導(dǎo)致蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化所致;而10MPa/40°C處理脂肪酶PCL的活力變化則與蛋白質(zhì)二級和三級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化有關(guān)。在亞臨界和超臨界條件下,處理時間對液體脂肪酶PC

8、L的三級結(jié)構(gòu)幾乎無影響。
　　4.高壓CO2對固體脂肪酶PCL催化特性的影響。采用中心實(shí)驗設(shè)計研究了壓力、溫度和處理時間對固體脂肪酶活力、結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的影響。實(shí)驗結(jié)果表明,亞超臨界CO2處理對固體脂肪酶PCL的活力都有不同程度的提高,最高活力分別為125.9%和130.4%,且超臨界CO2處理要明顯好于亞臨界處理,但壓力、溫度和處理時間對脂肪酶PCL的活力均沒有顯著性影響。紅外和熒光圖譜分析表明,亞臨界處理脂肪酶PCL的活力隨蛋白