鹽礦嗜鹽古菌多樣性及其產(chǎn)胞外蛋白酶初步研究.pdf

1、鹽礦是一類(lèi)極端高鹽環(huán)境，蘊(yùn)藏著豐富多樣的嗜鹽古菌類(lèi)群，是開(kāi)展嗜鹽古菌理論與應(yīng)用研究的珍貴資源。云南鹽礦作為我國(guó)重要的陸地高鹽環(huán)境，特殊的地質(zhì)構(gòu)造形成了鹽礦集中分布的特性，一平浪鹽礦就是其中規(guī)模較大的鹽礦之一。本文從云南一平浪鹽礦采集樣品，培養(yǎng)、分離、純化嗜鹽古菌測(cè)定嗜鹽古菌菌株的16S rRNA基因序列，揭示可培養(yǎng)嗜鹽古菌多樣性；對(duì)部分疑似新物種的菌株，進(jìn)行多相分類(lèi)學(xué)研究以確定它們的分類(lèi)地位；篩選出產(chǎn)胞外蛋白酶能力較強(qiáng)的菌株，對(duì)其所產(chǎn)粗

2、酶的酶學(xué)特性進(jìn)行初步研究。
　　基于16S rRNA基因序列分析與系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明：云南一平浪鹽礦的59株嗜鹽古菌分屬14個(gè)屬的20個(gè)分類(lèi)單元，其優(yōu)勢(shì)類(lèi)群為Natronococcus類(lèi)群、Natrinema類(lèi)群和Halococcus類(lèi)群。多相分類(lèi)學(xué)研究表明，菌株YPL13代表一個(gè)新種，菌株YPL18代表一個(gè)新屬。
　　篩選云南一平浪鹽礦分離的59株嗜鹽古菌，得到12株產(chǎn)胞外蛋白酶菌株，其中YPL20、YPL23、YPL2

3、4、YPL26產(chǎn)胞外蛋白酶水平最高，對(duì)其進(jìn)行16S rRNA基因和rpoB′基因序列分析，結(jié)果表明均為Halococcus salifodinae菌株，其中YPL20和YPL23為相同菌株，YPL24和YPL26為相同菌株。因此，選擇H. salifodinae YPL20和H. salifodinae YPL26作為進(jìn)一步研究對(duì)象。嗜鹽古菌胞外蛋白酶的表達(dá)與培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富情況尚未有過(guò)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)使用分別添加牛奶或明膠的營(yíng)養(yǎng)缺乏的NOM

4、、營(yíng)養(yǎng)適中的HM、營(yíng)養(yǎng)豐富的CM平板培養(yǎng)基培養(yǎng)H. salifodinae YPL20和H. salifodinae YPL26菌株并觀(guān)察胞外蛋白酶產(chǎn)生水平，結(jié)果表明H. salifodinae YPL20和H. salifodinae YPL26菌株胞外蛋白酶的產(chǎn)生受寡營(yíng)養(yǎng)條件的誘導(dǎo)，在 NOM培養(yǎng)基中產(chǎn)胞外蛋白酶水平最高。使用 NOM培養(yǎng)基培養(yǎng)H. salifodinae YPL20和H. salifodinae YPL26菌株并制

5、備粗酶液進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)表征，結(jié)果表明H. salifodinae YPL20和H. salifodinae YPL26分泌的胞外蛋白酶具有耐高溫耐鹽堿以及良好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性的特征，Mn2+對(duì)蛋白酶的酶活性表現(xiàn)出顯著的激活作用，而 Cu2+、Zn2+能夠抑制蛋白酶的活性。H. salifodinae YPL20的胞外蛋白酶最適反應(yīng)溫度為50℃，最適反應(yīng)pH為9.0，最適 NaCl濃度為0 M；H. salifodinae YPL26

6、的胞外蛋白酶最適反應(yīng)溫度為75℃，最適反應(yīng)pH為8.0-9.0，最適NaCl濃度為2.5 M。有趣的是，對(duì)氯汞苯甲酸PCMB和絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF均能夠抑制H. salifodinae YPL20和H. salifodinae YPL26的胞外蛋白酶活性，暗示著 H. salifodinae YPL20和 H. salifodinae YPL26的胞外蛋白酶粗酶液中可能存在著活性位點(diǎn)為半胱氨酸和絲氨酸的蛋白酶。因此，在未來(lái)的研究中