斑點(diǎn)叉尾鮰源嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌胞外蛋白酶的性質(zhì)及該菌檢測(cè)方法的建立研究.pdf

1、斑點(diǎn)叉尾鮰腸套疊癥(Infectious intussusception ofchannel catfish，IICC)是近年來(lái)在生產(chǎn)上出現(xiàn)的一種急性致死性斑點(diǎn)叉尾鲴的細(xì)菌性傳染病，該病具有發(fā)病突然，死亡率高，傳染快等特點(diǎn)，以體表出現(xiàn)圓形、橢圓形或不規(guī)則的褪色斑、腹水、腸炎以及后腸的腸套疊為病變特征，給我國(guó)斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本研究對(duì)引起該病的病原嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)

2、產(chǎn)生的胞外蛋白酶(Ex仃acellular proteaSe，ECPase)進(jìn)行分離、提純、特性分析、化學(xué)修飾及致病性研究，檢測(cè)該酶是否為S.realtophilia的主要致病因子，通過(guò)病理學(xué)及超微病理學(xué)技術(shù)，研究了胞外蛋白酶的主要致病過(guò)程。另建立了該病的PCR診斷方法和原位PCR診斷方法，為科學(xué)有效的檢測(cè)該菌及對(duì)疾病的診斷和監(jiān)控奠定了理論基礎(chǔ)和有效途徑。 以胰酪胨大豆肉湯(TSB)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，測(cè)定不同碳源、氮源、培養(yǎng)溫度和培

3、養(yǎng)基初始pH值對(duì)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌胞外蛋白酶產(chǎn)酶量的影響，用以確定該菌的最佳產(chǎn)酶條件。結(jié)果表明，ECPase的產(chǎn)量與培養(yǎng)基內(nèi)所含碳源、氮源、培養(yǎng)基初始pH值及培養(yǎng)時(shí)間等有很大關(guān)系，其最佳產(chǎn)酶條件為：以蔗糖作為碳源，酵母浸膏作為氮源，培養(yǎng)基初始pH值為7.0，在20℃溫度下120r/min振蕩培養(yǎng)72小時(shí)，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌可產(chǎn)生最大量的ECPase。 采用硫酸銨鹽析，DEAE SephadexA-50凝膠層析等方法從嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌

4、胞外產(chǎn)物中提純了一種分子量為45.7KDa的單一多肽蛋白酶，該酶的最適溫度為20℃，熱穩(wěn)定性差，100℃作用15min酶活完全喪失，最適pH為9.0，部分金屬離子如Ca<'2+>、Hg<'2+>、Cu<'2+>能使酶活性明顯下降，而Co<'2+>對(duì)酶有一定程度的激活作用，PMSF對(duì)酶活無(wú)明顯影響而EDTA能顯著降低酶活，證明該酶為一種堿性金屬蛋白酶。 同時(shí)利用PMSF、PCMB、N-AJ、Ch-T、NBS、2-ME等6種化學(xué)修飾

5、劑對(duì)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌胞外蛋白酶進(jìn)行化學(xué)修飾，研究酶分子中哪些氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)是表現(xiàn)酶活性所必需。結(jié)果表明Ch-T、NBS和2-ME能顯著抑制酶活性，而N-AI、PMSF和PCMB對(duì)酶活的影響不大，說(shuō)明蛋氨酸殘基、色氨酸殘基和二硫鍵是酶活性的必需基團(tuán)，而酪氨酸殘基、絲氨酸殘基和巰基與酶活性無(wú)直接關(guān)系。同時(shí)檢測(cè)了EDTA對(duì)酶活的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，：EDTA能顯著影響酶活性，證實(shí)該酶為一種金屬蛋白酶。 將提純的蛋白酶腹腔注射小鼠，小鼠

6、出現(xiàn)不同程度的死亡，其LD<,50>為4.33μg/g體重。死亡鼠出現(xiàn)嚴(yán)重胃腸道炎，胃嚴(yán)重脹氣，胃壁變得極度菲薄，腸脹氣，腸壁變薄，內(nèi)有淡黃色粘液；脾嚴(yán)重腫大、出血；肝臟極度腫大、出血。鏡下可見(jiàn)腸粘膜壞死脫落；心肌細(xì)胞嚴(yán)重顆粒變性；肝臟細(xì)胞腫大，變性，壞死；脾嚴(yán)重出血，脾白髓區(qū)充滿大量紅細(xì)胞。將提純的胞外蛋白酶腹腔注射健康斑點(diǎn)叉尾鲴后也出現(xiàn)不同程度死亡現(xiàn)象，其LD<,50>為3.49μg/g。病魚(yú)鰓絲腫脹；肝臟及腎臟腫大，質(zhì)地脆，有大小

7、不等的壞死區(qū)，肝細(xì)胞腫脹，嚴(yán)重空泡變性，大量細(xì)胞溶解消失，出現(xiàn)不同程度的溶解性壞死現(xiàn)象；腎小管上皮細(xì)胞嚴(yán)重空泡變性，細(xì)胞淡染，’逐漸溶解，消失，隱約可見(jiàn)細(xì)胞輪廓；脾臟稍腫大，嚴(yán)重出血；有輕微腸炎，但未見(jiàn)臨床上廣泛出現(xiàn)的腸套疊現(xiàn)象。同時(shí)將提純的蛋白酶做倍比稀釋后接種96孔板培養(yǎng)的Vero細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)該酶對(duì)Vero細(xì)胞具有明顯細(xì)胞毒性，細(xì)胞明顯變圓、壞死，脫落，在培養(yǎng)孔內(nèi)出現(xiàn)明顯空斑。 以16SrDNA.基因?yàn)榘行蛄?，通過(guò)與其他細(xì)菌相

8、關(guān)基因進(jìn)行比對(duì)，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，用以擴(kuò)增相應(yīng)的特異性片段，結(jié)果表明，對(duì)所得的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行擴(kuò)增，得到-428bp大小的單一DNA片段。同時(shí)對(duì)PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，當(dāng)50μl反應(yīng)體系中加入4pmol的引物、10pmol的dNTP、150pmol的MgCl<,2>、3.33U的Taq酶，以50℃為退火溫度，延伸溫度為72℃，延伸時(shí)間10min，25個(gè)循環(huán)后可以檢測(cè)到144.6ng的DNA模板，PCR擴(kuò)增效果較好。引物特異性

9、強(qiáng)，與其他假單胞菌屬、氣單胞菌屬細(xì)菌無(wú)交叉反應(yīng)，可用做檢測(cè)由嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌引起的水生動(dòng)物疾病的快速診斷。 通過(guò)腹腔注射的方法，將嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌人工感染斑點(diǎn)叉尾鲴，在感染后不同時(shí)間剖殺5尾魚(yú)，取心、肝、脾、腎、胃、腸、腦、鰓、皮膚、肌肉等組織進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片，應(yīng)用特異引物對(duì)病料組織切片進(jìn)行原位PCR擴(kuò)增和原位雜交檢測(cè)。結(jié)果：腹腔注射斑點(diǎn)叉尾鮰4小時(shí)后即可在肝臟中檢測(cè)到少量陽(yáng)性點(diǎn)，其余器官未出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)。感染8小時(shí)后即可在