寡養(yǎng)單胞菌G1菌mpd基因的克隆及甲基對硫磷解酶的性質(zhì)研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)室分離篩選出的微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌（ Stenotrophomonas acidaminiphila）G1能夠降解毒死蜱（CP）、甲基對硫磷（MP）、辛硫磷、二嗪磷、三唑磷（TAP）、丙溴磷。本文將編碼甲基對硫磷水解酶（MPH）的mpd基因，克隆到大腸桿菌上并成功表達(dá)，然后研究了溫度、pH、有機(jī)溶劑甲醇等對MPH活性的影響，比較G1菌粗酶液與構(gòu)建的大腸桿菌工程菌粗酶液對CP、MP、TAP的降解效果。
　　從G1菌中克隆長度為99

2、6 bp的mpd基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，獲得基因工程菌株，成功表達(dá)重組蛋白，重組后的 mpd基因編碼的甲基對硫磷水解酶（MPH），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后蛋白約30 KDa，檢測其酶活，重組后的蛋白能降解MP。
　　在研究溫度對MPH活性影響的時候，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度為47℃時，底物MP的降解率最高，說明MPH最適反應(yīng)溫度為47℃。在pH對MP H活性影響的實(shí)驗(yàn)中，在堿性條件下，底物MP的降解率均高于在中性條件下，這說

3、明MPH在堿性條件中的活性高，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MPH的最適反應(yīng)pH為9.1。在研究有機(jī)溶劑甲醇對MPH的活性影響實(shí)驗(yàn)時，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)添加的甲醇在整個體系的體積比為6％～50%之間時，這可以提高M(jìn)PH的活性，因?yàn)榈孜颩P的降解率明顯要高于不加任何甲醇的對照，當(dāng)添加的甲醇體積比超過50%后，MPH的活性被抑制，底物MP的降解很少，降解率小于不添加甲醇的對照組的降解率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)MP的降解產(chǎn)物PNP對MPH的活性沒有影響。
　　在G

4、1菌粗酶液與大腸桿菌工程菌粗酶液對兩種農(nóng)藥的降解實(shí)驗(yàn)中，工程菌粗酶液對C P、TAP的降解率明顯高于G1菌粗酶液，這是因?yàn)闃?gòu)建的工程菌大腸桿菌能夠大量表達(dá)MPH。在添加相同的總蛋白量時，G1菌粗酶液對CP的降解率高于對TAP的降解率。將G1菌粗酶液對MP的降解與G1菌對MP的降解結(jié)果比較，能夠發(fā)現(xiàn) G1菌在經(jīng)過16代傳代后，活力明顯下降，克隆的大腸桿菌因其能夠大量表達(dá)甲基對硫磷水解酶蛋白，所以其對MP的降解率高。在降解實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)添加的工