鄰單胞菌M6甲基對(duì)硫磷水解酶純化及性質(zhì)的研究.pdf

1、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文鄰單胞菌M6甲基對(duì)硫磷水解酶純化及性質(zhì)的研究姓名：徐瑋申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：李順鵬崔中利20050701摘要鄰單胞菌M6甲基對(duì)硫磷水解酶純化及性質(zhì)的研究捅姜在過(guò)去的二十余年里，科學(xué)家們對(duì)有機(jī)磷尤其是對(duì)硫磷的微生物降解進(jìn)行了廣泛而深入的研究。但是，有關(guān)微生物降解甲基對(duì)硫磷的研究報(bào)道并不多。我們實(shí)驗(yàn)室在前面的研究中成功地克隆出了一種全新的甲基對(duì)硫磷水解酶基因mpd；實(shí)現(xiàn)了甲基對(duì)硫磷水解酶基因在大腸

2、桿菌中高效表達(dá)，并闡明了該水解酶的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)。為了比較重組表達(dá)后融合蛋白與原始蛋白的差異，為甲基對(duì)硫磷水解酶的結(jié)構(gòu)功能和應(yīng)用研究提供背景數(shù)據(jù)，本論文旨在首先純化原始菌株鄰單胞菌M6中的MPH，并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行研究。并對(duì)另外兩株不同來(lái)源的MPH粗酶液性質(zhì)進(jìn)行了初探，以與鄰單胞菌M6中MPH—t$質(zhì)進(jìn)行比較。菌體超聲波破碎后得到的粗酶液經(jīng)熱變性、鹽析、二次離子交換層析等一系列步驟純化后，得到了比活提高了6118倍的純酶，整個(gè)純化過(guò)程的酶活力回

3、收率為504％。純化后的MPH經(jīng)SDS—PAGE驗(yàn)證為電泳純。酶譜顯示有活性。SDS—PAGE電泳顯示經(jīng)DEAE，Sephadex—A50陰離子交換層析后MPH已經(jīng)獲得了較好的純化效果，電泳圖譜顯示純化產(chǎn)物中只有兩條帶，此樣品再經(jīng)過(guò)CMSepharoseFastFlow陽(yáng)離子交換層析即得到電泳純的甲基對(duì)硫磷水解酶。與低分子蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物相比較，目的蛋白分子量大小約為33KD。建立了新的酶活反應(yīng)體系；酶活單位定義為在250C下每分鐘水解In

4、mol甲基對(duì)硫磷、乙基對(duì)硫磷或殺螟硫磷即產(chǎn)生1nmol對(duì)硝基苯酚或3一甲基對(duì)硝基苯酚所需要的酶量。根據(jù)細(xì)胞定位結(jié)果，M6產(chǎn)生的甲基對(duì)硫磷水解酶位于細(xì)胞內(nèi)，而且為組成酶。根據(jù)MPH對(duì)甲基對(duì)硫磷、乙基對(duì)硫磷以及殺螟硫磷的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，MPH對(duì)甲基對(duì)硫磷農(nóng)藥底物的親和力以及最大反應(yīng)速度要大于其對(duì)殺螟硫磷和乙基對(duì)硫磷的親和力和最大反應(yīng)速度，對(duì)甲基對(duì)硫磷的親和力為乙基對(duì)硫磷的118倍，最大反應(yīng)速度為乙基對(duì)硫磷的2000多倍。從kcat可眥看出MPH

5、對(duì)甲基對(duì)硫磷的水解效率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于乙基對(duì)硫磷和殺螟硫磷，分別為乙基對(duì)硫磷的490倍和殺螟硫磷的170倍。該酶對(duì)甲胺磷、久效磷以及敵敵畏都沒(méi)有明顯的降解作用，但能夠降解毒死蜱。過(guò)量底物，甲基對(duì)硫磷、乙基對(duì)硫磷、殺螟硫磷對(duì)甲基對(duì)硫磷水解酶均有抑制作用。當(dāng)以甲基對(duì)硫磷作為底物時(shí)，其降解產(chǎn)物對(duì)酶有抑制作用；而乙基對(duì)硫磷和殺螟硫磷的降解產(chǎn)物對(duì)酶沒(méi)有抑制。PNP作為三者共同的降解產(chǎn)物之一對(duì)酶活沒(méi)有抑制作用，甲基對(duì)硫磷的另一個(gè)降解產(chǎn)物二甲基硫代磷酸鹽對(duì)