兩株芽胞桿菌纖維素酶誘導(dǎo)產(chǎn)生機(jī)制及其作用的研究.pdf

1、纖維素是地球上數(shù)量最大的可再生資源，微生物對(duì)它的降解、轉(zhuǎn)化是碳素循環(huán)的主要環(huán)節(jié)。它的有效利用對(duì)于解決目前面臨的環(huán)境和能源危機(jī)具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。
　　本文采用剛果紅染色平板和液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，從土壤樣品和實(shí)驗(yàn)室保藏的菌種中篩選出兩株高產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌菌株。其中X18為我實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買(mǎi)的菌種，名為地衣芽胞桿菌（Bacilluslicheniformis）；而X10-1-2經(jīng)鑒定為蠟樣芽胞桿菌（Bacilluscereus）。這兩株菌均產(chǎn)

2、生胞外纖維素酶，且它們所產(chǎn)纖維素酶對(duì)結(jié)晶型纖維素的吸附能力都較弱，認(rèn)為它們的纖維素酶缺乏纖維素結(jié)合區(qū)。
　　通過(guò)對(duì)篩選得到的兩株高產(chǎn)纖維素酶的芽胞桿菌X18和X10-1-2的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得出以下結(jié)論：麩皮作為天然纖維素可較大幅度地提高纖維素酶的產(chǎn)量，兩株菌的最佳麩皮濃度為2.5％和3%。兩株菌的最佳氮源均為豆餅，最佳豆餅濃度分別為4%和1%。產(chǎn)酶的最佳溫度均為30℃。X10-1-2的最佳產(chǎn)酶pH為5，而X18的Cx酶在pH6

3、～8范圍內(nèi)產(chǎn)酶最高，本試驗(yàn)采用pH8。X18和X10-1-2的最佳產(chǎn)酶時(shí)間分別為20h和60h。
　　通過(guò)測(cè)定各種纖維素酶活性研究了不同碳源對(duì)兩株芽胞桿菌產(chǎn)纖維素酶的誘導(dǎo)作用。研究發(fā)現(xiàn)，這兩株芽胞桿菌不能由純的纖維素材料作單一碳源誘導(dǎo)產(chǎn)纖維素酶，而僅由帶有還原性基團(tuán)的單糖或雙糖誘導(dǎo)產(chǎn)酶，且纖維素酶系各組分的合成表達(dá)是協(xié)同發(fā)生的。同時(shí)，利用高效液相色譜對(duì)可誘導(dǎo)菌體產(chǎn)纖維素酶的物質(zhì)經(jīng)菌體胞壁（膜）酶和胞內(nèi)酶的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行定性分析后，發(fā)

4、現(xiàn)，兩株芽胞桿菌的胞壁（膜）酶和胞內(nèi)酶均未對(duì)這些可誘導(dǎo)菌體產(chǎn)纖維素酶的糖起到任何轉(zhuǎn)化作用。
　　利用這兩株芽胞桿菌分別對(duì)麥麩和稻草進(jìn)行降解。對(duì)發(fā)酵過(guò)程中上清液的還原糖濃度、可溶性總糖濃度、纖維素酶和半纖維素酶活的變化進(jìn)行了分析，同時(shí)測(cè)定底物殘?jiān)氖е?、結(jié)晶度、紅外光譜和表面結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明，菌體產(chǎn)酶的過(guò)程也是木質(zhì)纖維素的降解糖化過(guò)程。經(jīng)過(guò)5d的培養(yǎng)，麥麩和稻草中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素有了不同程度的降解。經(jīng)過(guò)降解，麥麩和稻草

5、的表面結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化。
　　將X10-1-2和X18分別培養(yǎng)60h和20h的發(fā)酵液采用3000rpm離心15min，上清液經(jīng)(NH4)2SO4分級(jí)沉淀、SephadexG-75凝膠過(guò)濾層析分離分別得到一個(gè)電泳純的內(nèi)切型-β-葡聚糖酶(CMCase)組分。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)均為單一條帶，來(lái)自X10-1-2和X18的CMCase的分子量分別為51.3kDa和37.2kDa。
　　來(lái)自X10-1-2和X18的CMCa

6、se的最適酶促反應(yīng)溫度分別為55℃和50℃，X10-1-2的CMCase在55℃以下具有良好的熱穩(wěn)定性，而X18的CMCase的熱穩(wěn)定性較差。兩株菌的CMCase最適pH值分別為8.0和9.0，且在pH7.0～9.0的中、堿性范圍內(nèi)都保持著較好的穩(wěn)定性。Mn2+、Fe2+和EDTA對(duì)X10-1-2的CMCase有一定的激活作用；而B(niǎo)a2+、Cu2+、Mg2+和C2O42-對(duì)CMCase有不同程度的抑制作用。對(duì)于X18的CMCase，F(xiàn)e

7、2+、Mn2+、Mg2+、Cu2+、Co2+和K+對(duì)纖維素酶在酶促反應(yīng)中有一定的激活作用；Zn2+、脲、SDS、Ba2+和Na+對(duì)纖維素酶在酶促反應(yīng)中均有不同程度的抑制作用。
　　對(duì)不同纖維素底物的專一性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這兩株菌的CMCase對(duì)羧甲基纖維素鈉的水解活性較強(qiáng)，但對(duì)Whatman濾紙和木聚糖也顯示出微弱的降解酶活性。以不同濃度的CMC為底物，根據(jù)米氏方程求出X10-1-2和X18的CMCase的動(dòng)力學(xué)參數(shù)分別為Km=2.