鞘糖脂人工生物合成關(guān)鍵酶的結(jié)構(gòu)、功能及分子改造.pdf

1、鞘糖脂是由神經(jīng)酰胺和寡糖鏈以糖苷鍵結(jié)合形成的雙親分子，作為人體內(nèi)重要的生物活性物質(zhì)，它們參與了多種生理和病理過程，如信號傳導(dǎo)、免疫、癌癥發(fā)生和胰島素抗性等。研究發(fā)現(xiàn)，鞘糖脂類具有作為疾病藥物、治療靶標(biāo)及潛在診斷標(biāo)記的潛力，因此對該類化合物制備及藥用研究受到學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。目前鞘糖脂類藥物的大量制備主要依賴從動物腦組織中提取，存在成本較高、來源有限，且有受瘋牛病等人畜共患病污染的潛在危險。通過工程化的系統(tǒng)設(shè)計，構(gòu)建鞘糖脂類體外生物合成體

2、系，探索相關(guān)酶催化及底物選擇性機(jī)制，不僅將深度揭示酶結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系，還將有助于實現(xiàn)鞘糖脂的高效、廉價合成。在本實驗室的前期工作中，已成功創(chuàng)建了鞘糖脂的體外多酶合成體系；為進(jìn)一步提高人工體系的運行效率，我們對多酶體系中的三類關(guān)鍵酶：鞘糖脂內(nèi)切糖苷酶、鞘糖脂N-去?；?、及巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶在酶學(xué)功能表征、結(jié)構(gòu)機(jī)制解析、酶分子改造等方面進(jìn)行了系統(tǒng)研究。
　　天然的鞘糖脂內(nèi)切糖苷酶（EGCase）催化鞘糖脂糖苷鍵的水解。但通過對其活性中心

3、的親核攻擊殘基進(jìn)行突變，可將EGCase改造為糖苷合成酶，從而催化氟代糖鏈模塊和鞘氨醇模塊縮合生成溶血鞘糖脂。我們通過數(shù)據(jù)庫搜索與活性測定，從 Rhodococcus equi103S基因組中鑒定了一個新的EGCase基因（EGCase I），其催化效率（kcat/Km）比目前廣泛使用的Rhodococcus sp. M-777鞘糖脂內(nèi)切酶EGCase II高130倍，且具有更廣泛的底物選擇性。為深入解析EGCase的作用機(jī)制，我們首次

4、解析了EGCase I的晶體結(jié)構(gòu)及其與GM1底物結(jié)合的復(fù)合體結(jié)構(gòu)，闡明了該酶具有高催化活性和寬底物特異性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。通過與EGCase II的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，鑒定了影響EGCase II活力的關(guān)鍵氨基酸，并在此基礎(chǔ)上通過理性設(shè)計獲得了活力提高10倍、且底物譜更寬的EGCase II突變酶，為構(gòu)建獲得高效的糖苷合成酶奠定了基礎(chǔ)。
　　鞘糖脂N-去酰基化酶（SCDase）能夠催化鞘糖脂中酰胺鍵水解或合成，是典型的雙功能酶。SCDase在

5、鞘糖脂人工合成體系中催化溶血鞘糖脂和脂肪酸鏈的縮合，生成完整的鞘糖脂結(jié)構(gòu)，是主要的限速步驟之一。為獲得更高效的SCDase催化元件，我們克隆并系統(tǒng)表征了來源于海洋微生物 Shewanella alga G8的鞘糖脂 N-去?；福⊿A_SCD）。SA_SCD與來自于Pseudomonas sp. TK4的商品化PS_SCD相比，水解活性高9倍，合成活性高38倍，而且可以更有效利用不飽和脂肪酸、極短和極長鏈脂肪酸合成鞘糖脂。SA_SCD

6、的優(yōu)良酶學(xué)特性以及能夠在大腸桿菌中異源表達(dá)的能力，使它在鞘糖脂高效生物合成及結(jié)構(gòu)衍生中具有良好的應(yīng)用潛力。
　　巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（FucT）可用來催化合成一系列含有巖藻糖基的鞘糖脂。由于此類鞘糖脂與多種癌癥發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，因此受到學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。為了提高巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的催化效率，我們首先使用來源于幽門螺桿菌H. pylori NCTC11639的α1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（FutA）作為模式酶，建立了適用于巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的FAC

7、S超高通量篩選方法，篩選速度達(dá)到每小時107以上。在模式篩選實驗中，表達(dá)了FutA的大腸桿菌從大量無酶活性細(xì)胞中富集的倍數(shù)高達(dá)104倍，而且可以對表達(dá)酶活力相差2倍的菌株進(jìn)行有效區(qū)分，證明了該方法的有效性。隨后我們對庫容量高達(dá)4×106的FutA隨機(jī)突變庫進(jìn)行3輪篩選獲得了催化活力明顯提高的突變體 A4（Y199N/V368A/D407N）和 D9（E340D）。在此基礎(chǔ)上，我們又設(shè)計了針對α1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的熒光受體底物，拓展了

8、該技術(shù)的應(yīng)用空間，為巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的大范圍改造奠定了基礎(chǔ)。
　　綜上所述，本論文圍繞鞘糖脂類人工合成體系的關(guān)鍵酶系進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)了性質(zhì)優(yōu)良的EGCase和SCDase新酶源，解析了EGCase的底物選擇性機(jī)制，開發(fā)了巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的高通量篩選方法，并通過分子改造獲得多種性質(zhì)更優(yōu)良的突變酶。本論文工作將有助于進(jìn)一步對鞘糖脂合成酶系進(jìn)行系統(tǒng)的人工設(shè)計和優(yōu)化，最終為實現(xiàn)重要鞘糖脂類藥物的高效合成和結(jié)構(gòu)創(chuàng)新提供技術(shù)源頭和理論支撐。