利用基因突變手段研究Pseudomonas putida的PHA合成途徑相關(guān)酶的功能及新型中長鏈PHA材料的生物合成.pdf

1、聚羥基脂肪酸酯(PHA)是細(xì)菌胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種多聚物，具有生物可降解性、生物相容性等優(yōu)良性能，有廣泛的應(yīng)用前景?？墒且呀?jīng)實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)的幾種PHA 材料在性能上還不能完全滿足實(shí)際需求，傳統(tǒng)中長鏈PHA含有多種單體，經(jīng)過水解后各種單體難以分離，因此，各國研究者都致力于開發(fā)性能更加優(yōu)良的中長鏈PHA 以及長鏈PHA 均聚物。本文圍繞利用基因工程手段來改造PHA 合成菌，通過提高其長鏈單體含量來改善其物化性能，并從而有可能在應(yīng)用上有所突破。

2、r>　　 本論文通過基因突變的手段來缺失惡臭假單胞菌P.putida KTOY08中的十個(gè)與PHA 合成以及菌體本身的β-氧化循環(huán)相關(guān)的基因，來分析基因的功能并篩選出高產(chǎn)菌株一株，能夠合成聚羥基癸酸酯及新型中長鏈聚羥基脂肪酸酯(mcl-PHA)的突變株一株并對其材料性能進(jìn)行研究。
　　 通過對各種突變菌菌在以月桂酸為單一底物的培養(yǎng)基中生物合成PHA的氣相色譜分析，我們發(fā)現(xiàn)基因PP3280、PP4636 以及基因PP2051、P

3、P2047、PP2048對于PHA 合成的影響比較大。其中基因PP2047 編碼3-羥基脂酰輔酶A 脫氫酶(3-hydroxyactyl-CoA dehydrogenase, FadB)，PP2048 編碼脂酰輔酶A 脫氫酶(Actyl-CoA dehydrogenase, FadE)，而基因PP2051、PP3280和PP4636 編碼的都是乙酰輔酶A 乙?；D(zhuǎn)移酶(Acetyl-CoA acetyl-transferase, Fad

4、A)的同功酶。基因PP3280和PP4636的缺失可以使突變菌株的PHA含量從缺失前的50wt%升高到90wt%。另外三個(gè)基因PP2051、PP2047 及PP2048的缺失則可以極大的削弱突變菌株的β-氧化，使得與底物脂肪酸鏈長相同的mcl-PHA中單體含量從15mol%增加到80mol%左右，而且可以合成聚羥基癸酸酯均聚物和只含有兩個(gè)長鏈單體的mcl-PHA。
　　 所有的突變菌中篩選出兩種比較理想的菌株KTQQ12和KTQ

5、Q20。KTQQ12是一株高產(chǎn)菌，在以月桂酸為單一底物的情況下，可以合成出占細(xì)胞干重(CDW)90wt%以上的PHA。這在中長鏈PHA(mcl-PHA)的生物合成中從來沒有過的。另外一株突變菌KTQQ20 可以在以癸酸為單一底物的情況下，合成出羥基癸酸酯，這也是首次在生物體內(nèi)合成長鏈的PHA 均聚物。在以月桂酸和十四酸為單一底物的情況下，其合成的共聚物P(16mol% 3HD-co-84mol%3HDD)和P(21mol% 3HDD-c

6、o-79mol% 3HTD)中與底物鏈長相同的單體的含量非常高，而且共聚物中只有兩個(gè)單體。相對于傳統(tǒng)mcl-PHA 來說，單體的均一性要高得多，從而對材料的熱力學(xué)性能有了較大的改善。
　　 最后，分析了所得的PHD、P(16mol% 3HD-co-84mol% 3HDD)和P(21mol% 3HDD-co-79mol% 3HTD)的三種mcl-PHA 材料的分子量分布，熱學(xué)性能，機(jī)械性能，熱穩(wěn)定性并與其他典型的mcl-PHA 性

7、能比較。均聚物PHD與長鏈PHA P(16mol% 3HD-co-84mol% 3HDD)和P(21mol% 3HDD-co-79mol%3HTD)的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度Tg 比野生型的KT2442 所合成的典型PHA的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度高7 到11 ℃。均聚物PHD 以及長鏈PHAP(16mol% 3HD-co-84mol% 3HDD)和P(21mol% 3HDD-co-79mol% 3HTD)的Tm分別是72 ℃、78 ℃和72 ℃。P(16