番茄萜類化合物生物合成途徑相關酶基因的克隆與分析.pdf

1、植物通過類異戊二烯生物合成途徑產生的萜類化合物(terpenoid)，對植物的正常生長發(fā)育以及植物與生態(tài)環(huán)境之間的聯(lián)系起著重要的作用。萜類化合物具有重要的商業(yè)價值以及生態(tài)意義，萜類代謝工程成為目前次生代謝工程的研究熱點，尤其隨著萜類代謝途徑以及調控機理的深入研究，以基因工程技術為基礎的代謝工程成為提高目標萜類產物的最有潛力的手段之一。然而，萜類代謝途徑關鍵酶基因的克隆與鑒定工作是利用相關酶進行基因操作進而提高植物目標萜類化合物產量的基礎

2、。
　　 番茄(Solanum lycopersicum)為世界性重要蔬菜作物，進行番茄萜類代謝工程研究具有重要意義，可以通過萜類代謝工程對番茄的品質、風味、抗病、抗蟲等性狀進行遺傳改良。目前，番茄萜類代謝工程已取得一定的研究進展，番茄萜類生物合成途徑的一些相關酶基因已被克隆并進行了轉基因研究，但還有部分關鍵基因還未被克隆。因此，本研究以番茄為材料，克隆分析了3個萜類化合物生物合成相關酶基因，豐富并進一步完善了番茄萜類化合物生物

3、合成途徑相關酶研究，為利用番茄萜類化合物生物合成途徑相關酶進行萜類代謝工程研究奠定基礎。本研究主要結果如下：
　　 1.以在GenBank搜尋到的煙草(Nicotiana tabacum)異戊烯基焦磷酸異構酶2(IPI2)基因(AB049816)的cDNA為信息探針，在TIGR番茄數據庫里BLAST到一條電子拼接序列TC183769，根據該TC克隆出番茄異戊烯基焦磷酸異構酶基因(SlIPI)的cDNA序列，其GenBank登錄號

4、為EU253957，測序結果表明，該cDNA全長708bp，編碼235個氨基酸，與TC183769的核酸同源性為99％，氨基酸同源性為100％。氨基酸序列比對結果顯示番茄IPI與其他植物IPI的同源性非常高。經預測分析該SlIPI不含有葉綠體信號肽，定位于細胞質與過氧化物體；SlIPI含有IPI蛋白質的重要的功能區(qū)域—NUDIX domain及活性位點Cys88和Glu149。三維結構模型分析表明，SlIPI與人類(Homo sapin

5、es)IPI結構非常相似。通過半定量RT-PCR進行IPI組織表達分析表明SlIPI在植物不同組織中表達水平有差異，在根中表達量最高。原核表達的重組SlIPI蛋白的分子量大小與通過軟件預測的分子量大小相同，為27.1KD。在大腸桿菌中超量表達SlIPI，可以推動萜類生物合成代謝流，促進β-胡蘿卜素的生物合成，從而驗證了SlIPI的功能。
　　 2.以在GenBank搜尋到的擬南芥(Arabidopsis thaliana)3-羥

6、基-3-甲基戊二酰CoA合成酶(HMGS)基因(NM_117251)的全長cDNA為信息探針，在TIGR番茄數據庫里BLAST到一條電子拼接序列TC176556，根據該TC克隆出番茄3-羥基-3-甲基戊二酰CoA合成酶基因(SlHMGS)的cDNA序列，其GenBank登錄號為EU253956，測序結果表明，該cDNA全長1389bp，編碼462個氨基酸，與TC176556的核酸同源性為99％，氨基酸同源性為99％。氨基酸序列比對結果顯

7、示番茄HMGS與其他植物HMGS的同源性較高。SlHMGS系統(tǒng)進化樹分析表明，SlHMGS與其他物HMGS具有共同的祖先。MotifScan分析表明SlHMGS含有3-羥基-3-甲基戊二酰CoA合成酶的活性位點。三維結構模型分析表明，SlHMGS與芥菜(Brassica iuncea)HMGS結構相似。原核表達的重組SlHMGS蛋白的分子量大小與通過軟件預測的分子量大小相同，為51.08KD。
　　 3.以在GenBank搜尋到

8、的橡膠樹(Hevea brasiliensis)甲羥戊酸-5-焦磷酸脫羧酶(MDC)基因(AF429368)的全長cDNA為信息探針，在TIGR番茄數據庫里BLAST到一條電子拼接序列TC172759，根據該TC序列克隆出番茄甲瓦龍酸-5-焦磷酸脫羧酶(SlMDC)基因的cDNA序列，其GenBank登錄號為EU216564，測序結果表明該cDNA全長1269bp，編碼422個氨基酸，與TC172759的核酸同源性為99％，氨基酸同源性