高價(jià)值萜類(lèi)化合物的微生物合成研究.pdf

1、萜類(lèi)是天然產(chǎn)物中重要類(lèi)群，在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要生理功能或生物活性，如抗瘧疾的青蒿素，抗乳腺癌的紫杉醇，抗氧化的番茄紅素，天然名貴香料檀香油等。這些高價(jià)值的萜類(lèi)化合物很多來(lái)自植物，但是從植物組織細(xì)胞中直接提取則費(fèi)時(shí)耗力，化學(xué)直接合成則成本高昂。隨著這些天然產(chǎn)物合成途徑的解析，當(dāng)前基于微生物的代謝工程手段給予了生產(chǎn)這些活性萜類(lèi)天然產(chǎn)物的新策略，通過(guò)選用安全可靠的宿主微生物，導(dǎo)入目標(biāo)化合物合成的特異性基因，甚至重新引入或改造整條代謝通路，優(yōu)化

2、特殊酶的表達(dá)系統(tǒng)并結(jié)合多種代謝工程手段，在諸如釀酒酵母體內(nèi)合成目標(biāo)天然產(chǎn)物，這種利用微生物來(lái)合成天然產(chǎn)物的手段比直接提取要高效節(jié)能。本研究選擇高價(jià)值的抗氧化劑和著色劑番茄紅素與名貴香料檀香油主成分前體物α-檀香烯作為目標(biāo)化合物做高產(chǎn)研究。本研究分為兩個(gè)部分：
　　第一部分：基于鏈霉菌底盤(pán)的番茄紅素高產(chǎn)研究。⑴宿主底盤(pán)Streptomyces avermitilis的選擇。番茄紅素高產(chǎn)研究多基于大腸桿菌和酵母底盤(pán)，但目前研究者在經(jīng)過(guò)

3、大量操作后，產(chǎn)量的提升空間已經(jīng)十分有限，本研究首次選用次級(jí)代謝產(chǎn)物豐富多樣的鏈霉菌作為底盤(pán)，挑選擁有大量萜類(lèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇的阿維鏈霉菌Streptomyces avermitilis作為宿主。⑵番茄紅素合成基因簇的選擇。通過(guò)S.avermitilis的基因組分析，發(fā)現(xiàn)其編碼的萜類(lèi)基因簇中蘊(yùn)含有一個(gè)沉默的番茄紅素合成的基因簇。本研究選取這個(gè)沉默的番茄紅素基因簇，作為表達(dá)番茄紅素的合成基因，通過(guò)過(guò)表達(dá)這一基因簇，成功實(shí)現(xiàn)這一基因簇的激活

4、，得到番茄紅素。⑶啟動(dòng)子元件選擇?；虻谋磉_(dá)與啟動(dòng)子關(guān)系密切，在鏈霉菌系統(tǒng)中，本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)建立基于流式細(xì)胞儀的熒光定量技術(shù)表征了系列的表達(dá)元件，研究中從啟動(dòng)子元件庫(kù)中選擇了系列啟動(dòng)子，通過(guò)Gibson assembly和Golden Gate技術(shù)構(gòu)建7種不同啟動(dòng)子元件驅(qū)動(dòng)的番茄紅素基因表達(dá)單元，利用整合型質(zhì)粒將表達(dá)單元整合到宿主基因組中，通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件，發(fā)酵檢測(cè)。結(jié)果顯示，隨著啟動(dòng)子強(qiáng)度的逐漸增強(qiáng)，番茄紅素的產(chǎn)量呈現(xiàn)先高后低的產(chǎn)量

5、變化，此時(shí)番茄紅素的產(chǎn)量在SP23啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下5天達(dá)到13.88 mg/gDCW水平。⑷絕緣子元件的引入。隨著啟動(dòng)子強(qiáng)度的逐漸增強(qiáng)，番茄紅素產(chǎn)量呈現(xiàn)先高后低的變化，這一現(xiàn)象可能是由于表達(dá)元件之間相互干擾所致，前人的研究中得知一類(lèi)絕緣子元件可以有效的減弱表達(dá)元件之間的干擾，研究中在系列啟動(dòng)子和crtE基因RBS之間引入絕緣子元件RiboJ，有效的消除了表達(dá)元件之間的干擾，隨著啟動(dòng)子的強(qiáng)度增強(qiáng)，菌株的番茄紅素的產(chǎn)量也逐步增加，番茄紅素在SP

6、44啟動(dòng)子的表達(dá)下獲得了82.02±8.69 mg/g DCW的產(chǎn)量，其菌株單產(chǎn)優(yōu)于大腸桿菌的現(xiàn)有水平。
　　第二部分：基于釀酒酵母底盤(pán)的a-santalene高產(chǎn)研究。⑴Saccharomyces cerevisiae底盤(pán)的選擇。由于α-santalol的合成途徑中涉及植物來(lái)源的真核系統(tǒng)依賴的CYP450依賴的單加氧酶和還原伴侶蛋白，研究選擇真核模式生物酵母菌為出發(fā)菌株，初步選擇烯烴代謝優(yōu)勢(shì)酵母Yarrowia lipolyti

7、ca，和改造實(shí)例豐富的S.cerevisiae。在對(duì)比菌株初始產(chǎn)量、產(chǎn)物比例和遺傳操作工具的前提下，選擇S.cerevisiae作為宿主菌株。⑵過(guò)表達(dá)tHMG1和ERG20。為了驗(yàn)證MVA途徑操作對(duì)增產(chǎn)的作用，研究中先采用GAL1-10p誘導(dǎo)型啟動(dòng)子體系（后期可以通過(guò)敲除GAL80，實(shí)現(xiàn)自誘導(dǎo)。）過(guò)表達(dá)MVA途徑的最重要的限速靶點(diǎn)截?cái)嘈虷MG-CoA還原酶基因HMG1和FPP合酶基因ERG20，并導(dǎo)入檀香烯合酶基因SaSSy，檢測(cè)到α-

8、santalene的產(chǎn)量提升約7倍。⑶底盤(pán)細(xì)胞代謝工程改造。上述操作有效后，采用MVA途徑全途徑過(guò)表達(dá)，其中tHMG1做三重過(guò)表達(dá)，對(duì)FPP的代謝點(diǎn)做限流優(yōu)化:首先，使用MET3p替換利用FPP合成甾醇的ERG9基因自身啟動(dòng)子，MET3p在外源添加甲硫氨酸時(shí)受到抑制;其次，敲除DPP1和LPP1這兩個(gè)利用FPP轉(zhuǎn)化為FOH的酶，實(shí)現(xiàn)對(duì)FPP代謝支路的抑制，在研究初期，使用GAL1-10p的半乳糖誘導(dǎo)體系，為增強(qiáng)誘導(dǎo)效果，敲除半乳糖代謝基

9、因GAL1，GAL10和GAL7。外源基因的表達(dá)前期使用低拷貝的游離型質(zhì)粒，后期采用高拷貝游離型質(zhì)粒。通過(guò)上述操作，α-santalene的產(chǎn)量再度提升約15倍，通過(guò)最終定量，α-santalene的產(chǎn)量在搖瓶水平，利用合成培養(yǎng)基，3天的產(chǎn)量達(dá)到182 mg/L。在使用經(jīng)密碼子優(yōu)化后的SanSyn基因替換SaSSy后，工程菌株BY4742-MVA-426-SanSyn的α-santalene產(chǎn)量為404.74±12 mg/L，為后續(xù)的α