1、萜類化合物MEP生物合成途徑中dxr基因的克隆表達(dá)及酶活性分析;2、野芝麻中環(huán)烯醚萜苷的生物合成研究.pdf

1、萜類化合物MEP生物合成途徑為人們提供了一個(gè)利用該途徑的關(guān)鍵酶為靶標(biāo)進(jìn)行抗菌素篩選的強(qiáng)有力的方法。1—脫氧—D—木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)化酶(DXR)是MEP生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一，在輔酶NADPH的存在下可以將DXP還原為MEP。鑒于DXR特定的性能，它正成為人們?cè)O(shè)計(jì)新型藥物的重要靶標(biāo)。這主要是因?yàn)榘ㄈ祟愔虏【趦?nèi)的大多數(shù)細(xì)菌都是通過(guò)MEP途徑來(lái)合成他們自身所需的萜類化合物，而在人體內(nèi)并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)DXR及其類似物的存在。因此，本研

2、究?jī)?nèi)容之一就是通過(guò)基因工程方法得到MEP途徑中的關(guān)鍵酶DXR，同時(shí)對(duì)該酶進(jìn)行了活性分析。 本研究以大腸桿菌基因組DNA為模板，經(jīng)PCR方法擴(kuò)增出編碼DXR的基因dxr，克隆入pET-15b載體中，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET15b—DXR，對(duì)獲得的pET15b—DXR重組質(zhì)粒擴(kuò)增后進(jìn)行PCR、酶切和測(cè)序鑒定。將鑒定完全正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS—PAGE電泳分析和Weste

3、rnblotting鑒定。SDS—PAGE分析出現(xiàn)一條約42 kDa的條帶，與預(yù)期融合蛋白的分子量相符，Western—blotting顯示誘導(dǎo)后的菌體在相應(yīng)的位置處出現(xiàn)特異性的雜交帶，最后進(jìn)行大量誘導(dǎo)并純化，得到了目的蛋白，產(chǎn)率10 mg/L、純度超過(guò)95％。用此融合蛋白作為生物酶催化劑，該酶可以催化DXP向MEP轉(zhuǎn)化。 環(huán)烯醚萜苷類化合物是一類特殊的單萜化合物，是一些植物的自身防御物質(zhì)，具有廣泛的生物活性，也是很多植物藥中的