鞘糖脂組學(xué)方法研究肝癌特征性鞘糖脂.pdf

1、第一章肝細(xì)胞肝癌實(shí)體瘤及相應(yīng)癌旁組織中的鞘糖脂表達(dá)的質(zhì)譜表征
　　目的：運(yùn)用糖組學(xué)方法研究肝細(xì)胞肝癌患者實(shí)體瘤樣本中的鞘糖脂表達(dá)情況，對(duì)比同一個(gè)體來(lái)源的癌旁組織，找出明顯差異表達(dá)的鞘糖脂結(jié)構(gòu)，從而找出肝細(xì)胞肝癌相關(guān)的特征性鞘糖脂為肝細(xì)胞肝癌診斷、治療等提供新的靶點(diǎn)，并為異常的鞘糖脂在肝細(xì)胞肝癌的生物學(xué)行為中所發(fā)生的作用提供初步的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
　　方法：(1)采用有機(jī)試劑溶液超聲波組合式提取的技術(shù)從肝細(xì)胞肝癌的實(shí)體瘤樣本中提取出

2、總脂質(zhì)；(2)利用DEAE-Sephedex A25層析法分離純化出酸中性鞘糖脂；(2)將所得的脂質(zhì)用乙酰化修飾并用硅酸鎂柱層析的方法去除其中的磷脂類(lèi)進(jìn)一步純化鞘糖脂；(4)HPTLC的方法初步分析從肝癌和癌旁組織中提取出來(lái)的鞘糖脂；(5)完全甲基化方法修飾所分離純化的鞘糖脂，并經(jīng)由LTQ-ESI MS質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行初步分析；(6) ROC曲線(xiàn)法分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)中異常的鞘糖脂。
　　結(jié)果：(1)同一個(gè)體來(lái)源的肝癌和癌旁初級(jí)總離子流譜圖顯

3、示出在肝癌中的m/z1600到m/z2000范圍內(nèi)出現(xiàn)的一群異常表達(dá)的鞘糖脂結(jié)構(gòu)；(2)2級(jí)質(zhì)譜分析研究的結(jié)果顯示有三組異常的鞘糖脂本別是m/z1086，m/z1260，m/z1290，這三組異常的鞘糖脂均為被巖藻糖基化所修飾，并發(fā)現(xiàn)這三組異常鞘糖脂在肝癌組織中的表達(dá)水平顯著高于相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)水平；(3)通過(guò) SPSS軟件的 ROC曲線(xiàn)法（受試者特征工作曲線(xiàn)）分析32對(duì)肝細(xì)胞肝癌患者的肝瘤組織以及相應(yīng)的癌旁組織質(zhì)譜總離子流圖數(shù)據(jù)發(fā)

4、現(xiàn)m/z1086的AUC（曲線(xiàn)下面積）值是0.809， m/z1260的AUC值是0.722，m/z1290的AUC值為0.953.
　　結(jié)論：肝細(xì)胞肝癌患者的實(shí)體瘤樣本中鞘糖脂的表達(dá)區(qū)別于同一個(gè)體來(lái)源的癌緣組織，其中在初級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)上可見(jiàn)明顯的一系列鞘糖脂的異常表達(dá)，這些明顯異常表達(dá)的鞘糖脂經(jīng)初步的結(jié)構(gòu)定性發(fā)現(xiàn)均為巖藻糖基化修飾的鞘糖脂結(jié)構(gòu)，受試者特征曲線(xiàn)說(shuō)明一群三組巖藻糖基化的鞘糖脂其作為診斷靶點(diǎn)具有診斷效力，說(shuō)明異常的巖藻糖基

5、化鞘糖脂作為治療診斷治療靶點(diǎn)的潛在價(jià)值。
　　第二章肝細(xì)胞肝癌中異常巖藻糖基化鞘糖脂的定性分析及其作為潛在靶點(diǎn)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)
　　目的：通過(guò)質(zhì)譜準(zhǔn)確定性異常的巖藻糖基化的鞘糖脂所有的結(jié)構(gòu)，并找出其中可以作為診斷治療靶點(diǎn)的的可能結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
　　方法：(1)利用多級(jí)質(zhì)譜方法結(jié)合相關(guān)的鞘糖脂標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行精確的異常鞘糖脂結(jié)構(gòu)的表征；(2) ChemDraw等結(jié)構(gòu)分析軟件的結(jié)合多級(jí)質(zhì)譜法結(jié)合定性；(3)多級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)肝癌細(xì)胞系的異常巖藻

6、糖基化鞘糖脂表達(dá)情況；(4)多級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)肝癌病患血清中異常巖藻糖基化鞘糖脂表達(dá)情況(5)采用Real-Time PCR技術(shù)檢測(cè)肝癌組織中相關(guān)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：(1)多級(jí)質(zhì)譜對(duì)異常巖藻糖基化的鞘糖脂表征揭示其中含有TypeⅠ/ⅡH antigen，Lewis x，Lewisy，Lewis a，Lewis b，Globo H等結(jié)構(gòu)，其中巖藻糖基化五糖m/z1086中主要成分為T(mén)ype H antigen，雙巖藻糖基

7、化六糖m/z1260含有Lewis b與Lewisy，巖藻糖基化六糖m/z1290是Globo H；(2)三種肝癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)了和肝癌組織中類(lèi)似的結(jié)果，均含異常糖基化鞘糖脂結(jié)構(gòu)，如Globo H；(3)肝癌患者血清鞘糖脂的質(zhì)譜表征發(fā)現(xiàn)有與肝細(xì)胞肝癌腫瘤組織相似的結(jié)果；(4)以糖組學(xué)的視角來(lái)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些異常的巖藻糖基化鞘糖脂均含有相同的末端Fucɑ1-2Gal-結(jié)構(gòu)域，其質(zhì)譜表征圖與Fucɑ1-2Gal的標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜表征圖高度匹配，

8、從而證實(shí)了我們的結(jié)果；(4)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶 FUT1和 FUT2的檢測(cè)結(jié)果表明在不同的肝癌個(gè)體樣本中其表達(dá)情況是不同的，揭示FUT1和FUT2在不同肝癌病人中其負(fù)責(zé)Fucɑ1-2Gal-的合成能力會(huì)有差異。
　　結(jié)論：肝癌樣本中異常表達(dá)的巖藻糖基化結(jié)構(gòu)含有H antigen，Globo H等多種的異常巖藻糖基化結(jié)構(gòu)，揭示肝癌樣本中鞘糖脂的異常巖藻糖基化是復(fù)雜多變的，然而糖鏈組成的特點(diǎn)讓我們能夠從糖鏈本身的結(jié)構(gòu)入手，找到異常巖藻糖基