采油微生物篩選、鼠李糖脂產(chǎn)脂性能及關(guān)鍵酶基因克隆與表達研究.pdf

1、世界范圍內(nèi)原油貯量的日益減少帶來了嚴重的能源危機，而以常規(guī)技術(shù)，一般只能開采出30％的原油，大量石油尤其是高粘油滯留在儲油層。微生物提高原油采收率(MEOR)是目前公認的開采油藏中剩余油和枯竭油藏最好的技術(shù)，對充分利用現(xiàn)有油礦藏資源，意義重大。另外，在石油的勘探與開采，運輸與儲存，煉制與使用過程中，常會造成石油外泄或不當排放，對環(huán)境造成嚴重的污染。應(yīng)用烴降解微生物對污染地區(qū)進行生物修復(fù)因其具有適用范圍廣、操作簡單、效果顯著、費用低、無二

2、次污染等優(yōu)點而被認為是解決復(fù)雜烴類污染的最徹底最有效的手段。 銅綠假單胞菌所產(chǎn)生的鼠李糖脂生物表面活性劑具有良好的表/界面活性和乳化活性，能形成膠束溶液，乳化分散烴類物質(zhì)，降低原油粘度；對烴類的增溶作用能促進微生物對烴類的攝取，從而提高微生物對烴類的降解效率；此外，作為生物表面活性劑又具有無毒、可生物降解的優(yōu)點。這都使其成為在MEOR和石油污染的生物修復(fù)領(lǐng)域中最佳的生物表面活性劑。 不同來源的銅綠假單胞菌其鼠李糖脂的組成

3、，性能，產(chǎn)量差距均較大，尋找合適石油工業(yè)的產(chǎn)脂菌株及其復(fù)配菌株具有重要價值。另外，銅綠假單胞菌雖然可高效產(chǎn)脂，但它是人體條件致病菌，不適合大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用。而利用基因工程的方法，將鼠李糖脂合成途徑中的關(guān)鍵酶--鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)入其它無害采油微生物受體中，構(gòu)建產(chǎn)鼠李糖脂的工程采油微生物直接應(yīng)用于生產(chǎn)可以有效避免菌株毒性。關(guān)于鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶基因在采油菌中的表達研究，少見國內(nèi)外報道。在此方面的研究可為基因工程菌在微生物采油和石油烴污染的生物修復(fù)

4、中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。本文主要從上述兩點展開進行研究工作，主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下： 1.產(chǎn)鼠李糖脂的原油降解菌的篩選與鑒定以原油為唯一碳源和能源，從油田樣品中分離篩選多株兼性厭氧原油烴類降解菌，通過表面張力測量從中篩選出產(chǎn)糖脂生物表面活性劑的原油降解菌SH6。通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實驗和16S rDNA序列分析鑒定其為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。該菌生長于原油培養(yǎng)基中，能很好的乳化分散原油，并

5、將原油發(fā)酵液的表面張力降至37.4 mN/m。經(jīng)GC-MS分析，P.aeruginosa SH6可以利用C13～C28較寬范圍的原油烴組分，其原油降解率為18.8％，原油粘度降低率為47.7％。利用TLC、IR及藍平板法分析，證明其產(chǎn)生的生物表面活性代謝產(chǎn)物為鼠李糖脂。 2.鼠李糖脂理化性質(zhì)和乳化活性的研究制備P.aeruginosa SH6所產(chǎn)的鼠李糖脂粗提樣品。利用HPLC-MS分離鑒定了其所產(chǎn)鼠李糖脂同系物中的組分。結(jié)果表

6、明，以甘油為唯一碳源時，P.aeruginosa SH6所產(chǎn)鼠李糖脂中主要包含8種同系物，都由1～2分子鼠李糖和1～2個C8～C12碳鏈長度的βP羥基飽合或不飽合脂肪酸組成。該鼠李糖脂粗品CMC為166.7 mg/L，在CMC時的表面張力為29.5 mM/m。該糖脂表現(xiàn)極高溫度(-20～120℃)和鹽度耐受性(小于50％NaCl，20％MgCl2和CaCl2)及優(yōu)良的環(huán)境穩(wěn)定性，并可在一定的pH范圍內(nèi)(1～7)保持活性。對液體石蠟、甲苯

7、、植物油和原油等疏水性有機物具有良好的乳化性能。這些性質(zhì)使得其在石油工業(yè)和石油污染修復(fù)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。 3.碳氮源對鼠李糖脂生產(chǎn)的影響就不同種類的碳源和氮源對P.aeruginosa SH6產(chǎn)脂的影響進行了研究。結(jié)果表明，P.aeruginosa SH6可以利用多種類型的碳氮源產(chǎn)脂。其中以葡萄糖與菜籽油(1:1)為復(fù)合碳源，酵母粉與硝酸鈉為復(fù)合氮源，且碳氮比為18:1時產(chǎn)脂量最高，達5.40 g/L。保持此最優(yōu)碳氮比加大

8、碳氮源濃度時，在碳源濃度為7％時產(chǎn)脂量最高，達6.37 g/L。這些研究為進一步的鼠李糖脂發(fā)酵生產(chǎn)條件的優(yōu)化和應(yīng)用不同碳氮源時所產(chǎn)鼠李糖脂組分與理化性質(zhì)的研究提供了依據(jù)和基礎(chǔ)。 4.鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及在大腸桿菌中的表達研究對P.aeruginosa SH6的鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)基因rhlAB和rhlABRI操縱子進行克隆與鑒定。構(gòu)建含鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶rhlAB和rhlABRI的重組質(zhì)粒pSAOR2和pJDOR4，利用鼠李糖基

9、轉(zhuǎn)移酶自身啟動子使其在大腸桿菌.E.coli SM10、E.coli DH50中進行表達。結(jié)果表明，只轉(zhuǎn)入結(jié)構(gòu)基因rhlAB的兩種大腸桿菌產(chǎn)脂量均很低；而轉(zhuǎn)入rhlABRI操縱子的兩宿主產(chǎn)脂量均有所提高，其中E coli DH5α產(chǎn)脂量最高達105.2 mg/L。僅管是應(yīng)用自身啟動子而不是強啟動子進行表達，這一產(chǎn)量在重組大腸桿菌表達鼠李糖脂的研究中仍是較高的，并且可以避免使用IPTG帶來的成本問題和操作上的麻煩。對鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶基因進行

10、克隆及在大腸桿菌中表達，為該基因在采油菌中的表達研究提供基礎(chǔ)。 5.鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶基因在采油微生物中的表達研究構(gòu)建了采油微生物接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，利用該系統(tǒng)成功地將含鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶rhlAB和rhlABRI的重組質(zhì)粒pSAOR2和pJDOR4轉(zhuǎn)移進入采油微生物受體菌中并進行了驗證。鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶基因在采油微生物中的表達情況與其在大腸桿菌中的表達情況基本一致。只轉(zhuǎn)入結(jié)構(gòu)基因rhlAB的兩種采油菌產(chǎn)脂量極低；而轉(zhuǎn)入rhlABRI操縱子的兩

11、宿主產(chǎn)脂量均有不同程度提高，其中Pseudomonas sp.JH4(pJDOR4)產(chǎn)脂量最高為101.8mg/L。這一表達量雖然沒達到期望的高效表達的水平，但還有進一步研究的空間，并且也為采油基因工程菌在微生物采油和石油烴污染的生物修復(fù)中應(yīng)用的可行性研究提供了理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)信息。 6.其它優(yōu)良MEOR菌株的研究在采油微生物的分離篩選過程中得到一株新的降蠟菌LH3，經(jīng)鑒定為友誼戈登氏菌。該菌株在好氧和厭氧條件下均能利用C10

12、～C36的烴組分生長從而降解石蠟，好氧時降蠟率約達18.0％，厭氧時降蠟率僅為好氧條件下的1/8。該菌最適生長溫度為37～40℃：在5％鹽濃度下能很好地生長，對10％高鹽濃度有一定的耐受能力；0.2％鼠李糖脂表面活性劑可以明顯促進其生長和提高降蠟率。此外，該菌能夠降解石油，降油率達到10.4％，降粘率達到44.7％。這些結(jié)果顯示，G.amicalis LH3作為微生物清防蠟菌劑有較好的應(yīng)用前景，在原油污染的生物修復(fù)和MEOR助采方面也具