生物脫膠關(guān)鍵酶基因的克隆和串聯(lián)表達(dá).pdf

1、生物脫膠是以生物催化劑催化非纖維素物質(zhì)降解為核心而獲得滿足后續(xù)加工要求的纖維素纖維的加工過程，具有低能耗、低污染、低成本等優(yōu)點(diǎn)，不僅能有效解決產(chǎn)業(yè)“節(jié)能、減排、降耗”的突出問題，而且可以提升麻纖維可紡性和麻紗質(zhì)量，滿足紡紗的要求，是產(chǎn)業(yè)的發(fā)展方向。目前，生物脫膠主要采取菌脫膠的方式。因此，菌種的優(yōu)劣是關(guān)鍵。本研究從脫膠菌株DCE-01（Dickeya dadantii DCE-01）與BE-91(Bacillus.subtilis)中克

2、隆了果膠酶基因、木聚糖酶基因、甘露聚糖酶基因三種脫膠關(guān)鍵酶基因，利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)基因的序列和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了模擬分析，用T4連接酶將引入特定酶切位點(diǎn)的不同基因組合以不同的排列順序串聯(lián)在表達(dá)載體上，分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌與脫膠菌株中表達(dá)，采用分子生物學(xué)、生物化學(xué)、酶學(xué)等方法，比較分析各基因的表達(dá)規(guī)律，獲得如下主要結(jié)果:
　　1.根據(jù)獲得的DCE-01全基因組序列和BE-91木聚糖酶基因序列，設(shè)計(jì)特異PCR引物，分別從兩個(gè)脫膠菌株中克隆到果膠

3、酶基因pel419(P，DCE-01)，甘露聚糖酶基因man(M，DCE-01)，木聚糖酶基因xyl(X，DCE-01)與91xyl(91X，BE-91)，測(cè)序結(jié)果表明4個(gè)基因的核酸序列與原始序列一致。序列分析顯示4個(gè)基因序列全長(zhǎng)分別為:1128 bp、1137 bp、1251bp、642 bp，編碼的氨基酸長(zhǎng)度分別為375AA、378AA、416AA、213 AA;核苷酸序列與其他微生物來源的果膠酶基因、木聚糖酶基因、甘露聚糖酶基因核

4、苷酸序列的一致性在76％-100％之間;蛋白分子量在24.28-45.74kDa之間，等電點(diǎn)5.71-8.67之間;4個(gè)基因均含有信號(hào)肽，跨膜位點(diǎn)在第24-32個(gè)氨基酸位置之間。
　　2.將DCE-01菌株的pel419、xyl、man基因與BE-91菌株的91xyl基因，分別按不同組合和順序串聯(lián)排列在載體pET28a(+)的MCS區(qū)域，成功構(gòu)建了6個(gè)生物脫膠多基因共表達(dá)質(zhì)粒28PXM、28MPX、28XMP、28PXM(91X)

5、、28MPX(91X)、28XMP(91X)，并分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌;轉(zhuǎn)化中間質(zhì)粒獲得帶有親本基因的對(duì)照菌株28P/BL21、28X/BL21、28M/BL21、28X(91X)/BL21。表達(dá)條件優(yōu)化后確定三種酶的最適底物分別為聚半乳糖醛酸、燕麥木糖、魔芋精粉，最佳培養(yǎng)條件為IPTG濃度1.0 mmol/L，轉(zhuǎn)速210 rpm，誘導(dǎo)時(shí)間21 h。SDS-PAGE電泳能較好的檢測(cè)到pel419、91xyl、man基因的蛋白條帶。平板法驗(yàn)證獲

6、得了較好的木聚糖和甘露聚糖水解圈。
　　3.用DNS法檢測(cè)6個(gè)多基因工程菌與4個(gè)親本基因工程菌三種關(guān)鍵酶酶活，數(shù)據(jù)表明:
　　不同基因串聯(lián)順序中:果膠酶的表達(dá)活力在5.57-414.74 U/mL之間，木聚糖酶的表達(dá)活力在2.05-671.80 U/mL之間，甘露聚糖酶的表達(dá)活力在17.52-87601.32 U/mL之間。基因在載體MCS區(qū)域中距啟動(dòng)子越近則表達(dá)效率越高?；蛱幱诘?號(hào)位時(shí)約為第2號(hào)位時(shí)的1.57-52.4

7、9倍，處于第2位時(shí)約為排列第3位的1.42-23.40倍;第1至第2號(hào)位的遞減幅度大于第2至第3號(hào)位;遞減幅度也基因種類而異，表達(dá)活力越高，下降幅度越大。
　　不同基因組合中:同屬木聚糖酶基因，91xyl基因的表達(dá)遠(yuǎn)高于xyl基因，活力約為后者的30.52-146.36倍;91xyl基因?qū)el419、man基因的表達(dá)有較為明顯的促進(jìn)作用。在相同的基因排列順序中，將xyl置換為91xyl后，果膠酶的表達(dá)增長(zhǎng)為原來的1.93-5.3

8、2倍，甘露聚糖酶的表達(dá)增長(zhǎng)為原來的4.07-29.70倍。另外，pel419、man、91xyl三個(gè)基因相互之間也有著較好的協(xié)同促進(jìn)作用。
　　4.對(duì)多基因工程菌株28PXM(91X)/B21及親本基因菌株28P/BL21、28M/BL21、28X(91X)/BL21分別進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)檢驗(yàn)，結(jié)果表明:28P/BL21的果膠酶、28X(91X)/BL21的木聚糖酶胞外酶活高于胞內(nèi)酶活，菌株28M/BL21中的甘露聚糖酶與菌株28PXM

9、(91X)/B21中的三種關(guān)鍵酶活力均為胞內(nèi)高于胞外。28PXM(91X)/BL21中各關(guān)鍵酶與親本基因菌株的熱穩(wěn)定性、酸堿耐受性表現(xiàn)趨勢(shì)基本一致，其中各關(guān)鍵酶在30℃-35℃時(shí)均能保證80％以上的酶活;同樣的pH區(qū)間內(nèi)，各關(guān)鍵酶因所在菌株不同而對(duì)pH耐受能力各有不同。與親本基因菌株相比，NH4+、Zn2+、Pb2+和EDTA更能促進(jìn)多基因重組菌28PXM(91X)/B21中果膠酶的活力表達(dá);Ca2+、NH4+、Fe3+、Cu2+、K+

10、更能促進(jìn)28PXM(91X)/B21中的木聚糖酶的酶活力提高，而Zn2+和Mn2+表現(xiàn)出抑制作用增強(qiáng)的效果;Pb2+可減弱對(duì)28PXM(91X)/B21中的甘露聚糖酶的抑制作用，EDTA、Mn2+與K+則表現(xiàn)為更為明顯的抑制作用。添加其余金屬離子后，親本單基因重組與多基因重組菌之間則沒有明顯變化。動(dòng)力學(xué)方面，28PXM(91X)/BL21中的三種關(guān)鍵酶Km值約為對(duì)應(yīng)各親本基因菌株的0.67倍、0.53倍、0.63倍;Vm為對(duì)應(yīng)親本菌株的