抗癌藥阿霉素關(guān)鍵合成酶基因的串聯(lián)異源表達(dá)研究.pdf

1、阿霉素是一種廣譜類抗腫瘤藥，因其較強(qiáng)的生物學(xué)活性而被廣泛用于臨床治療胃癌、肺癌、卵巢癌等疾病。到目前為止，阿霉素生產(chǎn)工藝落后、周期長(zhǎng)，致使其生產(chǎn)成本居高不下，精品阿霉素價(jià)格十分昂貴。隨著生物技術(shù)的逐步成熟，鏈霉菌Streptomyces ceucetius ATCC27952被報(bào)道具有天然合成阿霉素的代謝通路，相關(guān)基因也逐步被報(bào)道出來(lái)。本課題即利用相關(guān)基因克隆技術(shù)，試圖重新編排阿霉素相關(guān)合成酶基因，實(shí)現(xiàn)阿霉素相關(guān)酶基因在大腸桿菌(E.c

2、oli BL21)中的異源表達(dá)，期望研究阿霉素關(guān)鍵模塊的異源表達(dá)情況，從而期望利用生物發(fā)酵的方法解決阿霉素實(shí)際生產(chǎn)中遇到的困難。研究?jī)?nèi)容主要分為以下幾個(gè)方面:
　　1.阿霉素相關(guān)合成酶基因的單獨(dú)異源表達(dá)。在阿霉素生物合成途徑中，主要涉及相關(guān)合成酶基因24個(gè)，阿霉素主要抗性基因1個(gè)。利用分子克隆的技術(shù)構(gòu)建出表達(dá)載體18個(gè)并對(duì)其表達(dá)情況進(jìn)行SDS-PAGE分析表征，確定E.coli BL21可以用于表達(dá)阿霉素相關(guān)酶基因。
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3、.Ⅱ型聚酮合酶模塊是阿霉素前期合成的必經(jīng)模塊，本文章利用分子操作在大腸桿菌中構(gòu)建PKSⅡ的雙質(zhì)粒代謝途徑。實(shí)現(xiàn)Ⅱ型聚酮合酶模塊的構(gòu)建，以期實(shí)現(xiàn)多基因的協(xié)同表達(dá)。通過(guò)SDS-PAGE分析得到結(jié)論，相關(guān)質(zhì)?？梢栽贓.coli BL21中實(shí)現(xiàn)共同表達(dá)。
　　3.雙質(zhì)粒工程菌發(fā)酵檢測(cè)結(jié)果。通過(guò)M9培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程中對(duì)生物量與游離脂肪酸進(jìn)行檢測(cè)，以推斷代謝流狀況。并對(duì)36h發(fā)酵液進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，結(jié)果顯示沒(méi)有特征峰，相關(guān)后續(xù)檢測(cè)仍需進(jìn)行