馬鈴薯花色苷及其生物合成的主要關(guān)鍵酶基因的克隆與表達分析.pdf

1、馬鈴薯(Solanum tuberosum)是僅次于小麥、玉米和水稻的第四大糧食作物。其塊莖是繁殖器官，也是產(chǎn)品器官。塊莖有不同顏色，如白色、紅色和紫色?；ㄉ帐怯猩珘K莖顏色的決定因子，作為天然色素，花色苷可應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝品等行業(yè)。同時，它被證明具有抗癌、抗氧化和預(yù)防心血管疾病的作用。因此，近年來有關(guān)花色苷的生化與分子生物學研究，引起了全世界科學家的廣泛關(guān)注和濃厚興趣。 花色苷的生物合成途徑是被最為廣泛而深入研究的植物次

2、生代謝途徑，特別在主要模式植物中，已經(jīng)有了清楚的認識。一些花色苷生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因，已經(jīng)從馬鈴薯栽培種(S.tuberosum L)中克隆到，如CHS基因、F3H基因、DFR基因和F3’5’H基因，而在馬鈴薯野生種(S.pinnatisectum)中，還未見到花色苷生物合成酶基因克隆及其表達研究的報道。本研究以野生種為材料，克隆了CHS、F3H、．DFR和3G7’四個基因，分析了這四個基因的表達情況，通過轉(zhuǎn)基因?qū)?GI’基因進行

3、了功能驗證；以馬鈴薯栽培種(S.tuberosum cv_Chieftain)為材料，研究了CHS、F3H、．F3’5’H、DFR和3GT五個基因的組織表達和誘導表達。研究的主要結(jié)果如下： 1．馬鈴薯花色苷的種類、含量和穩(wěn)定性及影響其生物合成的因素用1％(v/v)鹽酸甲醇溶液分別從紅色和紫色馬鈴薯中提取色素，用正已烷除雜，再經(jīng)薄層層析(TLC)純化后，在紫外一可見分光光度計下掃描。根據(jù)提取液特性、Rf值和紫外一可見光譜特點，參考

4、已有相關(guān)資料，初步判斷馬鈴薯紫色色素主要為錦葵素的衍生物，而紅色色素主要為天竺葵素衍生物。紫色馬鈴薯的花色苷含量是紅色馬鈴薯花色苷含量的2.9倍。光、熱和pH值對花色苷的穩(wěn)定性有顯著影響，但紫色馬鈴薯花色苷的穩(wěn)定性好于紅色馬鈴薯花色苷。愈傷組織來源于馬鈴薯品種Chieftain，在紅色愈傷組織中，低濃度的2,4-D有利于花色苷的積累，高濃度的2,4-D促進愈傷組織的生長而不利于花色苷的積累；高濃度的6-BA能促進紅色愈傷組織中花色苷的積

5、累和誘導白色愈傷組織合成花色苷，但抑制生長；卡那霉素能使白色愈傷組織變紅并積累花色苷，隨著卡那霉素濃度的提高，愈傷組織生長受到嚴重抑制并最終變褐死亡；提高蔗糖濃度能促進馬鈴薯愈傷組織花色苷的產(chǎn)生和積累而抑制生長。 2．馬鈴薯野生種花色苷生物合成相關(guān)基因的克隆與序列分析設(shè)計簡并引物，通過RT-PCR方法從馬鈴薯野生種(S. pinnatisectum)紫色芽的cDNA中克隆到了CHS、．F3H、DFR和3GT基因的全長cDNA。序

6、列分析表明，以上四個基因分別編碼389、358、382和448個氨基酸殘基的多肽，在氨基酸水平上與茄科植物相應(yīng)多肽的同源性最高，達到76-96％；多重比較并口系統(tǒng)發(fā)育分析表明它們分別屬于各自基因家族中的一員。 3．馬鈴薯野生種3GT基因的功能驗證為了驗證馬鈴薯野生種3GT基因的功能，構(gòu)建帶CaMV 35S啟動子的表達載體pG3GT，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌Gv3101，用菌液浸泡花序法對擬南芥進行遺傳轉(zhuǎn)化，在含50mg/LKan的1/2MS

7、培養(yǎng)基上篩選，得到4個抗性幼苗，轉(zhuǎn)化率為0.13％，對移栽成活的3株進行PCR檢測為陽性，soutllern blot分析2株表現(xiàn)為陽性并為單拷貝整合。其中一株的葉片和莖桿顏色變成紫紅色，經(jīng)花色苷含量的測定表明其含量比野生型植株高出7.01倍，從而初步驗證了3GT基因的功能和活性。 4．馬鈴薯花色苷生物合成相關(guān)基因的表達分析用RT-PCR分析了馬鈴薯野生種的CHS、F3H、．DFR和3GT基因的空間表達情況，這些基因主要在花、匍

8、匐莖和頂芽中表達，除3GT基因外，其它3個基因在根中的表達沒有檢測到，CHS在根和塊莖中沒有檢測到。在馬鈴薯野生種的白色塊莖中這些基因在光誘導之前表達量很低或不表達，但在光照之后表達量顯著增加，隨著光照時間的延長，白色塊莖變?yōu)樽霞t色，花色苷大量積累。 用RT-PCR分析了CHS，F(xiàn)3R、F3’5’H和3GT五個基因在馬鈴薯栽培種Chieftain植株中的表達情況，結(jié)果表明，這些基因在匍匐莖的表達量最高，這與其花色苷積累量也較高是

9、相一致的。在塊莖中五個基因均有表達，但表達量相對較低，這可能與花色苷僅在紅色表皮組織中合成而在占大部分體積的白色薯肉中不合成有關(guān)。 在附加6-BA為2mg/L、2,4-D為0.5 mg/L的MS培養(yǎng)基上，分離到綠色、白色和紅色三種愈傷組織(細胞系)，三種愈傷組織在葉綠素和花色苷的含量上顯著不同，其中綠色和白色愈傷組織中幾乎不含花色苷，而紅色愈傷組織則大量積累花色苷。對CHS、F3H、DFR、F3’5’H和3GT五個花色苷生物合成

10、相關(guān)基因分析表明，綠色和白色愈傷組織不合成花色苷主要是由于DFR基因不表達造成的。 稀土元素鈰對馬鈴薯懸浮培養(yǎng)的愈傷組織中花色苷積累及其生物合成基因的表達有顯著影響。研究表明，低濃度Ce<'4+>能促進細胞和愈傷組織的生長，而高濃度Ce<'4+>則抑制生長并導致細胞死亡。不同濃度的Ce<'2+>能誘導正常的愈傷組織變紅并積累花色苷。RT-PCR分析表明，用0.1 mM Ce<'4>處理懸浮培養(yǎng)的愈傷組織能顯著誘導以上五個基因的表