廣譜性高效菌株DCE--01關(guān)鍵脫膠酶多基因同源共表達(dá)體系構(gòu)建.pdf

1、DCE-01是一株“廣譜性”、“高效性”脫膠菌，對(duì)多種草本纖維原料均能起到很好的脫膠作用，且6.0h能獨(dú)立完成苧麻脫膠，不需要其他化學(xué)方法后處理補(bǔ)充。其脫膠功能的廣譜性和高效性在國(guó)內(nèi)外都屬于領(lǐng)先地位。本文以DCE-01菌株為研究對(duì)象，從DCE-01菌株中克隆出3個(gè)關(guān)鍵脫膠酶基因，以2種不同的排列方式將這3個(gè)關(guān)鍵脫膠酶基因串聯(lián)起來(lái)，分別在大腸桿菌和DCE-01菌株中表達(dá)，獲得結(jié)果如下:
　　1.根據(jù)全基因組測(cè)序注釋結(jié)果設(shè)計(jì)特異引物，

2、從DCE-01菌株克隆出關(guān)鍵脫膠酶基因片段3個(gè):果膠酶基因(pelE)、木聚糖酶基因(xyn)及甘露聚糖酶基因(man)。經(jīng)測(cè)序及生物信息學(xué)分析:pelE核酸序列長(zhǎng)1185bp，編碼395個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量為43.8kDa;xyn核酸序列長(zhǎng)1251bp，編碼416個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量45.74kDa;man核酸序列長(zhǎng)1137bp，編碼378個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量41.85kDa。
　　2.通過(guò)設(shè)計(jì)特異引物和PCR擴(kuò)增獲

3、得帶有特定限制性酶切位點(diǎn)的關(guān)鍵脫膠酶基因（PelE基因、Xyn基因和Man基因）片段，經(jīng)酶切并與表達(dá)載體pET-28a連接，構(gòu)建成單基因表達(dá)重組子，同時(shí)，按照PXM、XPM的順序串聯(lián)排列在表達(dá)載體pET-28a的MCS區(qū)段上，構(gòu)建成多基因共表達(dá)重組子，然后，將單基因表達(dá)重組子和多基因共表達(dá)重組子導(dǎo)入BL21菌株中，成功構(gòu)建PelE、Man和Xyn的單基因表達(dá)重組菌株(pET-28a-P/BL21、pET-28a-M/BL21和pET-2

4、8a-X/BL21)和多基因共表達(dá)重組菌株（pET-28a-PXM/BL21和pET-28a-XPM/BL21）。
　　3.將構(gòu)建的重組子轉(zhuǎn)入到DCE-01（關(guān)鍵脫膠酶基因來(lái)源菌株）中，成功獲得單基因同源表達(dá)的重組菌株3個(gè)，包括pET-28a-P/DCE-01、pET-28a-X/DCE-01、pET-28a-M/DCE-01，多基因同源共表達(dá)的重組菌株2個(gè)，即pET-28a-PXM/DCE-01（或DCE01PXM）和pET-2

5、8a-XPM/DCE-01(或DCE01TM)。
　　4.對(duì)BL21系列重組菌株的酶活測(cè)定結(jié)果顯示:(1)pelE重組菌株所表達(dá)PelE酶活為471.97U/mL，而把pelE排列在啟動(dòng)子后面第一位和第二位所形成pET-28a-PXM/BL21和pET-28a-XPM/BL21時(shí)，對(duì)應(yīng)的PelE酶活分別是532.68U/mL和121.43U/mL。(2)xyn重組菌株所表達(dá)Xyn酶活為44.32U/mL，而把xyn排列在啟動(dòng)子后面

6、第一位和第二位所形成pET-28a-XPM/BL21和pET-28a-PXM/BL21時(shí)，對(duì)應(yīng)的Xyn酶活分別是47.43U/mL和31.42U/mL。(3)man重組菌株所表達(dá)Man達(dá)16882.86U/mL，而將man排在遠(yuǎn)離啟動(dòng)子位置形成的pET-28a-PXM/BL21與pET-28a-XPM/BL21時(shí)，對(duì)應(yīng)的Man酶活分別為645.21U/mL和230.83U/mL。因此，可以推論:(1)用于構(gòu)建多基因共表達(dá)體系的載體的啟動(dòng)

7、子對(duì)pelE的表達(dá)效果有顯著促進(jìn)作用;(2)構(gòu)建多基因共表達(dá)體系時(shí)，目的基因的表達(dá)效果與插入位點(diǎn)離啟動(dòng)子的距離呈負(fù)相關(guān)，即距離越遠(yuǎn)效果越差;(3)在多基因共表達(dá)體系中，man的表達(dá)效果受pelE插入位點(diǎn)的影響突出。
　　5.以DCE-01和DSM18020（模式菌株）為對(duì)照，對(duì)多基因同源共表達(dá)重組菌株純培養(yǎng)液的酶活測(cè)定結(jié)果顯示:(1)重組菌株DCE01PXM、DCE01XPM的PelE酶活性分別是DCE-01菌株的2.77倍、1.

8、01倍和DSM18020菌株的10.91倍、4.11倍;(2)重組菌株DCE-01PXM、DCE-01TM的Xyn酶活性分別是DCE-01菌株的1.28倍、1.82倍和DSM18020菌株的5.61倍、8.08倍;(3)重組菌株DCE-01PⅪM、DCE-01XPM的Man酶活性分別是DCE-01菌株的1.99倍、1.01倍和DSM18020菌株的6.16倍、3.16倍。由此可以得出結(jié)論:采用基因串聯(lián)方法將來(lái)自DCE-01菌株的關(guān)鍵脫膠

9、酶基因(pelE、xyn、man)整合到表達(dá)載體(pET-28a)中形成重組子，無(wú)論是導(dǎo)入原核表達(dá)菌株E.coli BL21(DE3)還是導(dǎo)入DCE-01菌株都獲得了成功表達(dá)，而且多基因同源共表達(dá)重組菌株表達(dá)PelE、Xyn、Man的酶活都高于DCE-01菌株。
　　6.液相色譜分析DCE-01、DSM18020、DCE-01PXM、DCE-01XPM菌株用于苧麻脫膠發(fā)酵液的結(jié)果表明:DCE-01PXM菌株的發(fā)酵液中檢測(cè)到的單糖含