產(chǎn)MTSase、MTHase融合酶菌株的構(gòu)建及其表達(dá).pdf

1、海藻糖是由兩分子葡萄糖通過(guò)α,α-1,1-糖苷鍵連接而成的非還原性二糖，對(duì)生物體具有良好的非特異性保護(hù)作用，被廣泛的應(yīng)用于藥品，食品，化妝品中，具有廣闊的應(yīng)用前景。目前生產(chǎn)海藻糖多為提取法，但產(chǎn)率低，遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)市場(chǎng)要求。本文以麥芽寡糖基海藻糖合成酶（MTSase）、麥芽寡糖基海藻糖水解酶（MTHase）為研究對(duì)象，通過(guò)插入不同的連接肽以及不同的融合順序，構(gòu)建產(chǎn)MTSase, MTHase的融合酶菌株，并進(jìn)行表達(dá)分析。
　　本研究

2、主要內(nèi)容包括：⑴氧化節(jié)桿菌（Arthrobacter oxydans）經(jīng)過(guò)發(fā)酵驗(yàn)證后，證明其菌株中含有海藻糖合成相關(guān)酶MTSase和MTHase。根據(jù)同源比對(duì)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，通過(guò)基因工程手段，分別得到了mtsase基因序列全長(zhǎng)2328 bp，編碼775個(gè)氨基酸，mthase基因序列全長(zhǎng)1770 bp，編碼589個(gè)氨基酸。經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)分析顯示，與Arthrobacter phenanthrenivorans Sphe3的核苷酸序列一致性均

3、為87％。⑵設(shè)計(jì)無(wú)縫克隆引物，通過(guò)PCR得到目的基因mtsase和mthase，分別與雙酶切后的表達(dá)載體pET-22b進(jìn)行連接，實(shí)現(xiàn)了MTSase和MTHase在大腸桿菌中的表達(dá)。重組MTSase和重組MTHase的酶活力分別為17.85 U/mL和15.16 U/mL。在40℃，pH7.0的條件下，以4%的直鏈淀粉為底物，兩種酶聯(lián)合作用反應(yīng)24 h，海藻糖的轉(zhuǎn)化率為45.87%。⑶選擇(GGGGS)2和(EAAAK)3作為連接肽，并設(shè)

4、計(jì)了 mtsase-mthase以及mthase-mtsase兩種連接順序，成功構(gòu)建了4種產(chǎn)MTSase和MTHase融合酶的菌株。重組融合酶菌株經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE均檢測(cè)到融合蛋白，分子量大小約為160KDa。在催化直鏈淀粉反應(yīng)中，4種融合酶都表現(xiàn)出了雙酶的功能，其中，融合酶SP2H具有較高的酶活力為11.53U/mL。⑷通過(guò)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基單因素條件的優(yōu)化以及酶學(xué)性質(zhì)的研究，得到了適合該重組融合酶的發(fā)酵培養(yǎng)基M9-ZJ-LM-