重組大腸桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成D-苯基乳酸的基礎(chǔ)研究.pdf

1、苯基乳酸（phenyllactic acid,PLA），是一種天然有機酸，廣泛存在于乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品和蜂蜜中，因其對細(xì)菌和真菌等食源性微生物具有廣譜抑制活性，可在食品領(lǐng)域用作新型生物防腐劑而受到越來越多的關(guān)注。此外，該物質(zhì)在制藥業(yè)、畜牧業(yè)和化妝品工業(yè)也有重要用途。
　　生物轉(zhuǎn)化合成苯基乳酸包括體外酶轉(zhuǎn)化法、微生物發(fā)酵法和全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法。其中酶轉(zhuǎn)化需要溫和的條件且對外界環(huán)境不穩(wěn)定，而發(fā)酵法具有生產(chǎn)周期長、底物利用率低和產(chǎn)物分離純化工藝復(fù)

2、雜等缺點。本研究為了獲得高產(chǎn)和高光學(xué)純度的D-苯基乳酸，將野生型和突變型D-乳酸脫氫酶基因?qū)氪竽c桿菌，同時引入NADH輔因子再生體系，以苯丙酮酸鈉為底物，全細(xì)胞合成D-苯基乳酸。主要研究成果如下：
　?。?）以植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）基因組為模板，經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到乳酸脫氫酶基因(D-ldh)，連接表達(dá)載體pET-28a并導(dǎo)入宿主菌。重組大腸桿菌在1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行SDS-P

3、AGE檢測，結(jié)果顯示在41kD處有顯著性蛋白條帶，表明該 D-乳酸脫氫酶基因在重組大腸桿菌中成功表達(dá)。與對照組相比，工程菌乳酸脫氫酶酶活和生物轉(zhuǎn)化能力顯著上升，測得乳酸脫氫酶粗酶活為6.3 U/mg，苯基乳酸產(chǎn)量達(dá)到5.01 g/L，HPLC手性分析顯示，D-苯基乳酸光學(xué)純度達(dá)到100％。
　?。?）為了提高野生型乳酸脫氫酶對底物的催化活力，將乳酸脫氫酶（LDH）結(jié)合位點第52位殘基酪氨酸（Tyr）定點突變成亮氨酸（LDHY52L

4、）、丙氨酸（LDHY52A）和纈氨酸（LDHY52V）三種疏水性小氨基酸。在三株突變菌中，與原始菌E.coli pET-28a-ldh相比，工程菌E.coli pET-28a-ldhY52V粗酶催化活力和轉(zhuǎn)化能力最高，乳酸脫氫酶酶活提高17.8倍，苯基乳酸產(chǎn)量提高21%。本研究對該工程菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化，最佳的誘導(dǎo)條件為：誘導(dǎo)溫度25℃、誘導(dǎo)劑濃度0.2 mmol/L、誘導(dǎo)時間4 h、誘導(dǎo)時機為菌體濃度OD600達(dá)到1.2時添加

5、誘導(dǎo)劑。最佳轉(zhuǎn)化條件為：pH7.0，轉(zhuǎn)化溫度37℃，底物濃度8 g/L，葡萄糖濃度10 g/L，1%Triton X-100和1 mmol/L Mg2+。在以上最優(yōu)的條件下通過間斷補充底物和葡萄糖進(jìn)行流加培養(yǎng)，在三個小時內(nèi)，E.coli pET-28a-ldh苯基乳酸產(chǎn)量達(dá)到12.16 g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率為61%。突變菌株E. coli pET-28a-ldhY52V苯基乳酸產(chǎn)量達(dá)到15.56 g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率為77%。以上結(jié)果表明，

6、利用重組大腸桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化苯丙酮酸合成苯基乳酸具有現(xiàn)實可行性，乳酸脫氫酶定點突變提高了苯基乳酸的產(chǎn)量和底物轉(zhuǎn)化率。
　?。?）為了進(jìn)一步提高重組大腸桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平，將來自博伊丁假絲酵母（Candida boidinii）甲酸脫氫酶基因和大腸桿菌（E.coli）葡萄糖-6-磷酸脫氫酶分別與乳酸脫氫酶共表達(dá)，以強化輔因子再生。單批次全細(xì)胞轉(zhuǎn)化結(jié)果顯示，E.coli pETDuet-ldhfdh苯基乳酸產(chǎn)量較E.coli pETDu

7、et-ldh提高13%，而E.coli pETDuet-ldhzwf不僅沒能提高苯基乳酸產(chǎn)量，相反，較E.coli pETDuet-ldh降低近一半。本文對E.coli pETDuet-ldhfdh作進(jìn)一步流加培養(yǎng)。最優(yōu)的轉(zhuǎn)化條件下，E.coli pETDuet-ldhfdh苯基乳酸產(chǎn)量為18.15g/L，生產(chǎn)強度為4.54 g/L/h，摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到94%。本研究D-苯基乳酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率不僅達(dá)到較高水平，也為重組大腸桿菌生物合成有價值