實(shí)驗(yàn)八、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化

1、實(shí)驗(yàn)八 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.了解轉(zhuǎn)化的概念及其在分子生物學(xué)研究中的意義。2.學(xué)習(xí)氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的方法。3.學(xué)習(xí)將外源質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)入受體菌細(xì)胞并篩選轉(zhuǎn)化體的方法。,實(shí)驗(yàn)原理,轉(zhuǎn)化( Transformation )是將異源 DNA 分子引入另一細(xì)胞品系，使受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。,轉(zhuǎn)化中的受體細(xì)胞,轉(zhuǎn)化過(guò)程所用的受體

2、細(xì)胞一般是限制性修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株，常用 RM 符號(hào)表示。,轉(zhuǎn)化方法：電擊法、 CaCl2、 RuCl等化學(xué)試劑法感受態(tài)細(xì)胞：的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源 DNA 分子通過(guò)時(shí)細(xì)胞的狀態(tài)。轉(zhuǎn)化細(xì)胞(轉(zhuǎn)化子)：帶有異源 DNA 分子的受體細(xì)胞( Transformant )。,實(shí)驗(yàn)原理,實(shí)驗(yàn)原理,本實(shí)驗(yàn)以 E.coli DH5α 菌株為受體細(xì)胞，用 CaCl2 處理受體菌使其處

3、于為感受態(tài)，然后與 pUC18質(zhì)粒共保溫，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。 pUC18質(zhì)粒攜帶有抗氨芐青霉素的基因，因而使接受了該質(zhì)粒的受體菌具有抗氨芐青霉的特性，用 Apr符號(hào)表示。將經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化后的全部受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)適應(yīng)稀釋，在含氨芐青霉素的平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，只有轉(zhuǎn)化體才能存活，而未受轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞則因無(wú)抵抗氨芐青霉素的能力而死亡。,,,,,,,抗Amp,,,宿主細(xì)菌,,,,,,,含Amp培養(yǎng)基,影響轉(zhuǎn)化率的因素,細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度。 轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒 DNA 的

4、質(zhì)量和濃度。 試劑的質(zhì)量。 防止雜菌和其它外源 DNA 的污染。,實(shí)驗(yàn)儀器,超凈工作臺(tái),臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),恒溫空氣搖床,恒溫培養(yǎng)箱,培養(yǎng)皿,實(shí)驗(yàn)試劑,大腸桿菌DH5α  LB培養(yǎng)基，  0.1mol/LCaCl2溶液（預(yù)冷）  氨芐青霉素 pUC18質(zhì)粒,實(shí)驗(yàn)步驟,菌株活化 感受態(tài)細(xì)胞制備 外源DNA的轉(zhuǎn)化,實(shí)驗(yàn)步驟,菌株活化用接種環(huán)直接取凍存的大腸桿菌DH5α，在LB培養(yǎng)基平板

5、表面劃線，于37℃培養(yǎng)16小時(shí)挑取一個(gè)單菌落，轉(zhuǎn)到3－5ml LB培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)3－5小時(shí)將培養(yǎng)液全部轉(zhuǎn)到100ml LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)2－3小時(shí)，到OD600＝0.3－0.4,實(shí)驗(yàn)步驟,感受態(tài)細(xì)胞制備將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，在冰上放置15－30min4000rpm離心5min,棄上清加入0.8ml預(yù)冷的0.1mol/l CaCl2,懸浮沉淀，冰上預(yù)冷10min4000rpm離心5 min,棄上清加入0.2m

6、l預(yù)冷的0.1mol/l CaCl2,懸浮沉淀，即可使用。也可加入總體積15％的甘油 可－70℃長(zhǎng)期保存,實(shí)驗(yàn)步驟,轉(zhuǎn)化 取目的DNA加入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，于冰上放置30min 于42℃水浴90S冰上放置2min加入800μl LB液體培養(yǎng)基于37培養(yǎng)1小時(shí)將培養(yǎng)液均勻涂布在含Amp+的培養(yǎng)基平板上將平板放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-14個(gè)小時(shí)，然后觀察結(jié)果,對(duì)照組,對(duì)照組1: 以同體積的無(wú)菌雙蒸水代

7、替DNA溶液,其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的LB平板上應(yīng)沒(méi)有菌落出現(xiàn)。 對(duì)照組2: 以同體積的無(wú)菌雙蒸水代替DNA溶液,但涂板時(shí)只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此組正常情況下應(yīng)產(chǎn)生大量菌落。,轉(zhuǎn)化率,統(tǒng)計(jì)每個(gè)培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)。 　　轉(zhuǎn)化后在含抗生素的平板上長(zhǎng)出的菌落即為轉(zhuǎn)化子，根據(jù)此皿中的菌落數(shù)可計(jì)算出轉(zhuǎn)化子總數(shù)和轉(zhuǎn)化頻率，公式如下： 　　轉(zhuǎn)化子總數(shù)＝菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×轉(zhuǎn)化反

8、應(yīng)原液總體積／涂板菌液體積 　　轉(zhuǎn)化頻率（轉(zhuǎn)化子數(shù)／每mg質(zhì)粒DNA）＝轉(zhuǎn)化子總數(shù)／質(zhì)粒DNA加入量(mg) 　　感受態(tài)細(xì)胞總數(shù)＝對(duì)照組２菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×菌液總體積／涂板菌液體積 　　感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率＝轉(zhuǎn)化子總數(shù)／感受態(tài)細(xì)胞總數(shù),,實(shí)驗(yàn)結(jié)果,實(shí)驗(yàn)報(bào)告,寫明實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)原理、儀器、材料與試劑詳細(xì)列出實(shí)驗(yàn)步驟；畫出實(shí)驗(yàn)結(jié)果的示意圖并做分析，計(jì)算轉(zhuǎn)化效率。,1. 在制備感受態(tài)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中要注意哪些