nm23-h1基因轉(zhuǎn)染前后人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株l9981pka活性變化的實(shí)驗(yàn)研究

1、中 國(guó)肺 癌 雜 志 2 0 0 4年 4月第 7卷 第 2期 C h i nJL u n gC a n c e r ，Ap r i l2 0 0 4 ，V o 1 ． 7 ，No ． 2· 9 l· 研 究 生 專 欄 ·n m23 一 H1 基因轉(zhuǎn)染前后人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌 細(xì)胞株L 998 1P KA 活性變化 的實(shí)驗(yàn)研 究 李 定彪 周 清華 王艷 萍 朱文 陳小禾 楊俊 杰 劉倫旭 付 軍科 聶強(qiáng)

2、李 印【 摘要】目的 探／ , 1 ‘ n m2 3H轉(zhuǎn)染和 f o r s k o l i n對(duì)人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺 櫥細(xì)胞侏 1 ． 9 9 8 1P KA活性 的影響。方 法 應(yīng)用 IK A通路特異激 動(dòng)剎 f o r s k u l i n對(duì) 人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺痛原代 細(xì)胞侏 I8 l 、 轉(zhuǎn)基 岡細(xì)胞株 1 ． 9 9 8 1n r n 2 3 一 H一 p IXS N和空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞 株 1 ． 9 9 8 1p IX S N共

3、同培養(yǎng) ， 應(yīng)用放 飽法檢 測(cè) f u r s k o l i n處理后 不 同時(shí)問(wèn)點(diǎn)二個(gè)細(xì)胞 株 P K A 的活性變化 。結(jié)果 ( 1 ) f o r s k o l i n處押前 1 ． 9 9 8 1 、 1 ． 9 9 8 lp IX S N和 1 ． 9 9 8 ln m2 3Hp IX S N的 P KA活性經(jīng) F檢驗(yàn)有 著性差異( P 00 ． 0 1 ) ； 兩兩 比較 ： 1 ． 9 9 8 1n m2 3H． p

4、IX S N的 P KA活性 著高于 1 ． 9 9 8 1和 1 ． 9 9 8 1p IX S N( P r c gu l a t et h ePKA a c t i v i t yo fh u ma nh i g h — me t a s t a s i sl a r g ec e l ll u n gc a n c e rc e l ll i n e1 ． 9 9 8 1 ．a(chǎn) n di t sf u n c t i o na

5、sal u H l o rmc t a s t a s i s本研究受國(guó)家 自然科學(xué)基金 ( N o ． 3 0 0 7 0 3 3 3 和 N 0 ． 3 0 1 O O 0 7 5 ) 資助作者 單位： 6 1 0 0 4 1成都． 四川大學(xué)華西醫(yī)院P q ) r l 省肺癌 分子重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 、 ~~ b f g ( 通訊作者 ： 周清華 ． Em a i l ： z h 【 ) l 1 ( 1 h ( qm a i l ．c n

6、i n f 。 ． 眥I )維普資訊 http://www.cqvip.com 1 o “ l 加到 S A M生物素俘獲膜上 ， 然后把膜按下列順序洗脫 ： 2 0 0ml2t o o l ／ IN a C 13 0s ， 一次 ； 2 0 0ml2t oo lLNa C l2r ai n ， 3次 ； 2 0 0ml2t oo l ／ INa C 1 加 1H． ． P O2r ai n ， 4次 ； 去離 子水 中洗 3 0s ，

7、 2次。率溫 3 0r ai n使膜 干燥 ， 然后進(jìn)行 液閃計(jì) 數(shù) 。P KA活性 以每 克蛋白 每分鐘摻入的 A T P物質(zhì)的量[ f , m o l ／ ( r a i n ·g ) ] 來(lái)表示 。1 ． 3統(tǒng)計(jì) 學(xué)處 理 采 用 S S P S 1 1 ． 0對(duì)所 得 數(shù)據(jù) 進(jìn) 行 處理 ， 行 F檢驗(yàn) ， 以 P ％0 ． 0 5 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果 2 ． 1 不 同肺 癌細(xì) 胞株 P KA 活 性 比較 L

8、9 9 8 1n m2 3H一 p IX S N、 L 9 9 8 1和 L 9 9 8 1p IX S N 的 P KA 活性 分 別 為 ( 1 ．9 4± 0 ．6 2) 、( 0 ．4 l± 0 ．0 5)和 ( 0 ．4 8±0 ． 0 1 ) “ t oo l ／ ( r a i n· g ) 。三 個(gè)細(xì)胞 株 問(wèn) P K A 活性 有 顯 著性 差 異 ( P( ) ． 0 5 )

9、。2 ． 2 不 同濃 度 f o r s k o l i n對(duì)二 個(gè) 肺 癌 細(xì)胞 株 P KA 活 性 的影響 ( 圖 1 )在 f o r s k o l i n濃 度 為 0 、 l 、 1 0g m o l ／ I時(shí) ， L 9 9 8 1 一 n m2 3 一 H一 p IX S N 的 P K A 活 性 均 顯 著 高 于 L 9 9 8 1 和 L 9 9 8 1p IX S N( P 0 ． 0 5 ) ； f o

10、r s k o l i n濃 度 為 1 0 0mo l ／ I時(shí) ， 三個(gè) 細(xì)胞株 之 間 的 P KA 活性 無(wú)顯 著性差 異 ( P>0 ． 0 5 ) 。每 個(gè)細(xì)胞株 隨 f o r s k o l i n濃 度遞 增 ， P K A 活性 顯著增 加 ( P0 ． 0 5 ) ； 在 作用 3 0mi n時(shí) 者 問(wèn)比較無(wú) 顯著性 差異 ( P>0 ． 0 5 ) 。在 每 個(gè) 細(xì)胞株 中 ， P K A 活性 在

11、f o r s k o l i n作 用時(shí) 間為3 0r ai n時(shí)均顯著高于其他時(shí)間點(diǎn) ( P <0 ． 0 1 ) ， 在6 0r a i n 時(shí)明顯下 降 ， 旱 現(xiàn)時(shí) 間依 賴 的關(guān) 系。 而對(duì) 照組 中 DMS ( ) 對(duì) P KA 的活忡 無(wú) 明顯影 響 。一一r ，一 一 一— ． r - I9 9 81 一p L XSN—廣 -L 9 9 81 一p L XSNeo i l t l ‘ o l— 卜 L 9 9

12、 8l —n r n 23 ． H l— e_ 1 , 9 9 8I —n m2 3一 H lco nt r o l圖 21 ． 9 9 8 l 、 1 ． 9 9 8 lp 1XS N和 L 9 9 8 ln m2 3 一 H【 p lXS N 細(xì) 胞 株 中 IKA活性 與 f o r s k o l i n時(shí) 效 火 系 F i g2Th er e l a l i o n s h i pb e l we e nl l i ea

13、c l i o nI i meo ff o r s k o l i na n dl h eP KA a c t i v i t yo fJ9 9 81 。 I J 9 9 81 一 p lXSNa n dI9 9 8卜n m2 3H1p IXSNc e l ll i n e s3 討 論 n m 2 3 基因足 1 9 8 8年 S t e e g 等 ] 從小 鼠黑色素瘤 K17 3 5 細(xì)胞株中應(yīng)用消減 雜交法分離出來(lái)的能抑制 肺

14、癌轉(zhuǎn) 移 的 c DNA 克隆 ， 原 位 雜交 顯 示 n m2 3基 因在 低轉(zhuǎn) 移 克隆株 C。中 RNA 表 達(dá) 比高 轉(zhuǎn) 移 克 隆株 TK高 1 0 倍 。已發(fā)現(xiàn) 人 n m2 3基 岡有兩 個(gè) 、 J型 ， 即 n m2 3H和 n m2 3H， 皆佗 于 人 染 色體 17 { t。處 ， 分 別 編碼 18 ． 5k u和 1 7k I l 兩 種 蛋 白 。人 n m2 3編碼 的蛋 白氨 基酸 序列 與分子 量為

15、1 7k u的核 苷酸 二磷 酸激 酶 ( n u —c l e o s i d ed i p h o s p h a t ( - k i n a s e ， ND P K) 高 度 同源 。 目前 研究 已證 實(shí) n m2 3基 因水平 的低表 達(dá) 或雜 合性 缺 火 和 多種腫瘤的高轉(zhuǎn)移擇 卡 力 、 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和預(yù)后不 良有關(guān) ， 而且常伴 有 一 些 腫 瘤 侵 襲 相 關(guān) 分子 的 異 常 。陳 曉 峰 、 周 清華 等 的

16、研 究 觀察 到 人 大 細(xì)胞 肺 癌 細(xì) 胞 株 L 9 9 8 1的高侵 襲性 幣 ¨ 高轉(zhuǎn) 移潛 能 可 能 與 r i m2 3H的等位 基 因 缺 失 有 關(guān) ， 并 證 實(shí) 轉(zhuǎn) 染 野 生 型 n m2 3H．c D NA可 以調(diào)控 下游 的轉(zhuǎn) 移相 關(guān) 基 因從 而逆 轉(zhuǎn)肺 癌 的 轉(zhuǎn)移表 型 ， 而 n m2 3H基 可 能是上 游關(guān) 鍵基 因 。N D P K是一類定位于胞漿 內(nèi)的蛋 白， 參 與高能磷維普資