趨化實驗

1、IL-8生物活性的測定,基本原理：IL-8是典型的CXC家族趨化因子，對嗜中性粒細胞和T淋巴細胞有趨化作用。IL-8的趨化作用沒有種屬特異性，因此，可以用豚鼠嗜中性粒細胞代替人嗜中性粒細胞對其進行活性檢測。,趨化因子誘導的細胞移動方式有兩類：化學增活現(xiàn)象，指增強細胞的隨機運動，瓊脂糖小滴化學動力實驗是檢測這種活性的比較簡易，快速，重復性好的方法。趨化性，指誘導細胞向趨化因子化學濃度高的方向移動。瓊脂糖中的趨化

2、實驗和微孔小室中的趨化實驗則是常用的測定細胞因子趨化活性的方法。,微孔小室中的趨化實驗：微孔小室中的趨化實驗是根據(jù)靶細胞（單核巨噬細胞，中性粒細胞或淋巴細胞等）能夠趨化性主動遷移，穿過一定孔徑的濾膜而設(shè)計的。濾膜將小室分隔成上下兩部分。靶細胞在上面，趨化因子在下面，趨化因子通過濾膜形成梯度，細胞則沿著梯度穿過膜孔，黏附在膜的下面，計數(shù)濾膜下表面的細胞數(shù)即可測出趨化因子的趨化能力。,,,趨化材料和趨化時間的選擇：

3、趨化濾膜的材料和孔徑需根據(jù)靶細胞的大小選擇；中性粒細胞用3μm孔徑的PVPF聚碳酸膜（ Polycarbonate membranes）, 趨化時間為30分鐘；單核細胞用8µm孔徑的PVPF聚碳酸膜，趨化時間為90分鐘；粘附力弱的淋巴細胞則用表面復以明膠或纖粘素的5µm或8µmPVPF聚碳酸膜，以免淋巴細胞穿過膜后落入下室，趨化時間為180分鐘。,不同趨化因子濃度的確定：趨化因子特異活

4、性非常高，某些趨化因子在較高濃度時促進細胞趨化的作用反而降低，所以待測樣品常需連續(xù)5倍或10倍系列稀釋以獲得最適劑量的趨化結(jié)果。每次實驗都需設(shè)好對照，因為不同來源或活力靶細胞的趨化能力差異很大,趨化因子活性的表達方式有三種，其中最常用的是用趨化指數(shù)表示，趨化指數(shù)（chemotactic index,CI）是指細胞遷移到待測樣品液的數(shù)目和遷移到對照液的數(shù)目的比值。,試劑和材料：純化的IL-8

5、 注射器，離心管，移液器，Tip頭 0.17% D(+)-糖原/生理鹽水 解剖器械（剪刀，鑷子，止血鉗）PBS, 紅細胞裂解液 趨化小室，趨化濾膜，細胞刮子Serum-free RPMI1640 計數(shù)板，玻璃片，顯微鏡，甲醇，Gimsa染色液 紅細胞裂解液： 豚鼠中

6、性粒細胞， 0.17M Tris/0.16MNH4Cl液體石蠟， 將10ml0.17MTris加到90ml 0.16M NH4Cl中，調(diào)PH7.2,,實驗程序：一豚鼠嗜中性粒

7、細胞的制備：1）取成年豚鼠1只，腹腔注射含0.17%糖原的生理鹽水，13小時后，用PBS緩沖液沖洗腹腔，收集腹腔液，1500rpm/min 10min,棄上清。2）輕輕彈起沉淀，用3-5ml PH 7.2的37℃預溫的（ Tris-NH4CL） 紅細胞溶解液，充分吹散，作用3-5分鐘，立即加入10-15ml serum-free RPMI1640,吹打均勻，1500rpm/min 5min,棄上清，再加入serum-free R

8、PMI1640,離洗兩次。得到豚鼠嗜中性粒細胞，純度可達97%以上。3）將純化后的嗜中性粒細胞溶在serum-free RPMI 1640中，細胞計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為5x105/ml，備用。,二．樣品的準備：將純化的IL-8用PBS分別稀釋為1000ng/ml,100ng/ml,10ng/ml,1ng/ml,0.1ng/ml。同時用稀釋IL-8的PBS作陰性對照。（樣品加入小室前最好放入37℃培養(yǎng)箱中預溫， 以免

9、加樣時出氣泡）。,2 3 4 5 6 7IL-8(1µg) PBS PBS PBS PBS PBS PBS 180µl 180µl

10、 180µl 180µl 180µl 100µl 20µl 20µl 20µl 20µl 20µl 20µl(棄去20µl),,倍比稀釋(1:10),,,,,,倍比稀釋(1:2)真核上清

11、 PBS PBS PBS200µl 100µl 100µl 100µl100µl 100µl 100µl 100µl（棄去100µl）（載體對

12、照稀釋同上）,,,,,三．準備底層小室，加樣：1）將趨化小室底層板放水平臺上，NP標記位于右下方。2）將稀釋好后預溫的樣品加入孔中，使液面微微隆起，每孔27µl， （國產(chǎn)板每孔25µl），每個樣品3個復孔。為防止樣品過度蒸發(fā)，整個加樣過程應不超過5分鐘。3）將適當孔徑的濾膜取出，在濾膜的一角剪去1mm的小角，缺角對 著NP標記，分別用鑷子夾住濾膜兩端，水平下降，中間部位最先接觸小室液面，將膜平放

13、在加完樣的底層板上。4）鋪上硅膠墊，裝上上層板，硅膠墊的缺角及上層板的NP標記位于右下方。裝上螺絲，擰緊裝置。,四．加入細胞：1）將已稀釋好的細胞懸液加入上層小孔中，每孔50µl，加樣時微量加樣器Tip頭貼著小孔壁，Tip頭末端恰好位于濾膜稍上方，垂直快速加樣，避免孔底滯留氣泡，（注意這一步加樣過程中一定不要有氣泡形成）。2）檢查上層液體中是否有氣泡，一個比較簡便的方法是觀察小孔凸的反射光，如果小孔上方

14、有一個異常大的凸液面，通常表明有滯留氣泡。解決的辦法是用Tip頭將孔中的液體吸干凈，重新加樣。,五．孵育：將趨化小室放入37℃ 5%CO2孵箱中，孵育30分鐘。,六．取出濾膜，清洗，染色： 1) 取出濾膜，擰下螺帽，將整個小室倒置，托著上層板的四角， 將小室慢慢地水平放在紙巾上，卸下下層板。 2) 清洗，遷移細胞現(xiàn)位于濾膜朝上的一面，此面稱為細胞面，另一面為 非細胞面，用鑷子夾起濾膜的一角，然后用大

15、塑料夾夾住濾膜這一端距邊緣1mm的寬度，拎起濾膜，迅速用塑料夾夾住濾膜另一端。在盛有PBS緩沖液的平皿中沾濕非細胞面，注意細胞面不要接觸到PBS。 3) 在細胞刮上刮去非細胞面上的細胞，靠近大夾子處的濾膜先接 觸細胞刮，在與細胞刮成30度角方向輕輕上拉，該過程重復兩 次。 4) 固定，小心將濾膜浸入甲醇中，室溫3分鐘，將濾膜取出，用塑 料夾夾住，自然干燥。5) 染色，將固定后的濾膜在Gimsa染色液中染

16、色30分鐘，自來水沖洗，置于玻片上，顯微鏡下觀察。 6) 計數(shù)，在高倍鏡下，每孔隨機選取5個視野，累積細胞數(shù)，算出三個復孔的平均值。作為該稀釋度的遷移細胞數(shù)。,IL-8組趨化的細胞數(shù)與緩沖液對照組中趨化細胞 數(shù)的比值即為趨化指數(shù)，趨化指數(shù)大于2有意 義。,技術(shù)要點： 1）.分離純化嗜中性粒細胞時，要仔細認真保證細胞活力。 2）.每次做實驗均要設(shè)陰性對照，用真核細胞轉(zhuǎn)染上清做趨 化實驗時，要設(shè)空載體

17、轉(zhuǎn)染上清做陰性對照。 3）.向趨化小室下孔中加樣品時，上樣量要適中，使之能形 成稍微隆起的液面，既能防止氣泡形成，又可以防止樣 品發(fā)生交叉污染 4）.每個樣品要做三個復孔。 5）.放膜時要對準位置，過多調(diào)整位置，易發(fā)生交叉污染。 6）.洗膜時注意，不要把細胞面與非細胞面弄反。 7）.不同趨化因子的趨化譜不同，用不同細胞做趨化反時， 應選用不同孔徑的濾膜、不同的細胞濃度和不同的趨