肝癌細胞在不同受體趨化劑中的趨化行為及其與整合素和細胞骨架的關系.pdf

1、趨化最初是單細胞生物某些細胞最基本最原始的運動形式，像變形蟲，溶組織阿米巴等靠體表任何部位形成的臨時性的細胞質突起（偽足）作為運動器而運動。很多資料認為：偽足的形成是由于骨架再組裝驅動，特別是肌動蛋白微絲骨架的重組。偽足作為一個突出的小泡出現(xiàn)在顯微鏡下，有時沿著下層基質變的扁平（像扁平足），有時更圓或離開表面（像頭足）。從熒光顯微鏡或電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)：這個區(qū)域總是包含有密集的F-actin微絲網(wǎng)絡和少量的微管。盡管actin微絲在偽足形成

2、時所起的作用或多或少的已被接受，人們對于產(chǎn)生推力的機理仍舊有不同的意見。涉及到推力的模型從肌動蛋白在膜上直接起作用，到肌漿球蛋白的收縮，或可利用的凝膠滲透壓驅使F-actin微絲網(wǎng)絡凝膠化等等均被提出來說明偽足的擴展。 本文應用生物力學、細胞生物學、光鏡和電鏡技術以肝實質癌細胞（hepatocellular carcinoma cells，HCC）為研究對象，用不同受體的趨化劑作用于肝癌細胞SMMC-7721株，通過微吸管吸吮技

3、術和Boyden小室來研究其趨化特性，觀察肝癌細胞在趨化劑IV型膠原、層粘連蛋白、組織胺作用下對細胞偽足相互作用的影響。本研究方法具有直觀、精細，易定量的特點；深入研究癌細胞趨化行為和分子機制，進而防治侵襲和轉移，具有現(xiàn)實意義。 本課題的主要研究內(nèi)容及結果如下： （1）用單微吸管法研究肝癌細胞在IV型膠原（type IV collagen，Col IV）、層粘連蛋白（laminin，LN）、組織胺（Histamine）趨

4、化作用下偽足生長的動態(tài)過程，同時考察了肝癌細胞偽足的形成分別對趨化液中ColIV、LN和組織胺濃度的依賴性。隨著ColIV趨化劑濃度的增加（100 μg/ml~400 μg/ml），HCC細胞的偽足長度增加；當ColIV濃度≥400 μg/ml時，細胞偽足的長度基本不變。隨著LN趨化劑濃度的增加（50 μg/ml~200 μg/ml），HCC細胞的偽足長度增加；當LN濃度≥200 μg/ml 時，細胞偽足的長度基本不變。而組織胺（0.0

5、5 ng/ml~500 ng/ml）對肝癌細胞無趨化特性。 （2）應用雙微吸管法研究濃度不對稱趨化實驗中雙側偽足形成的相互影響和趨化劑種類不同時趨化性偽足形成的強度。結果表明：一側ColIV濃度固定，另一側隨著組織胺濃度升高，細胞偽足長度逐漸降低；雙側偽足一側因組織胺趨化濃度升高而偽足生成減弱并未使另一側偽足生成增強。隨著組織胺濃度增加（0.5 ng/ml~50 ng/ml）組織胺濃度為0.5 ng/ml，5 ng/ml和50

6、ng/ml時，偽足的峰值長度分別為3.03±0.54 μm，0.94±0.52 μm，2.07±0.55 μm。，偽足的峰值在5 ng/ml時降到最低。另側在ColIV濃度為200 μg/ml趨化下偽足的長度跟單微吸管同樣濃度趨化作用下偽足長度無明顯差別 。 （3）用單微吸管法研究用細胞松弛素D（cytochalasin D，CD）及鈣離子（Ca2+）作用于細胞后，IV型膠原趨化作用下偽足形成的趨化過程。隨著CD濃度的增加（0.

7、5 μg/ml~2.0 μg/ml），HCC偽足長度減小，當CD濃度為2.0 μg/ml時，細胞偽足的長度最短；隨著Ca2+濃度的增加（1 μmol/l~3.0 μmol/l），HCC偽足長度減小，當Ca2+濃度為3.0 μmol/l時，細胞偽足不再形成。光鏡和電鏡技術顯示了細胞骨架的變化。加入2.0 μg/ml 濃度的CD和3.0 μmol/l Ca2+化后，細胞骨架的分配與未加入干擾劑的對照組相比，骨架大部分發(fā)生紊亂，小部分開始溶解

8、甚至消失。 （4）采用單微吸管研究整合素單克隆抗體Anti-CD49a~Anti-CD49d阻斷后，IV型膠原趨化作用下偽足形成的趨化過程，以證實付遍紅的結果。隨著微吸管內(nèi)Anti-CD49a和Anti-CD49d混合物濃度的增加（5 μg/ml，10 μg/ml ，20 μg/ml），HCC仍有明顯偽足形成同時與肝癌細胞未阻斷時的偽足長度相比，偽足的變化不明顯（P>0.05）。而隨著Anti-CD49b和Anti-CD49c濃

9、度的增加（0.5 μg/ml~2.0 μg/ml），在抗體濃度較低（5 μg/ml）時，仍可見有偽足形成；當抗體濃度較高時(≥10 μg/ml)，此時與肝癌細胞經(jīng)Anti-CD49b或Anti-CD49c阻斷時偽足長度相比，偽足受到明顯的抑制（P<0.01）。 （5）采用Boyden小室來研究在Boyden小室中偽足在不同濃度的ColIV和組織胺趨化液作用下偽足的趨化遷移性。在ColIV濃度為200 μg/ml時，細胞移動數(shù)目為

10、541.06±40，ColIV濃度為400 μg/ml，600 μg/ml時，細胞移動數(shù)目分別為720.36±60，924.21±71。當ColIV濃度≥600 μg/ml，細胞移動數(shù)目基本不變；而組織胺幾乎無趨化性。然后研究細胞松弛素D和組織胺對群體細胞在ColIV趨化下的遷移運動的影響。用細胞松弛素D作用于HCC后，隨著濃度的增大（0.5 μg/ml~2.0 μg/ml），細胞移動的數(shù)目逐漸減少，對其的遷移運動的抑制較控制組顯著（p

11、<0.01）。而組織胺作用于細胞后，細胞移動數(shù)目減少，當組織胺濃度為10-10,10-9 ,10-8,10-7 mol/L時，細胞移動數(shù)目分別是939.2±41，831.1±52，521.2±89，648.9±75，細胞遷移性降低，在組織胺濃度為10-8 mol/L時細胞移動數(shù)目最低，與控制組相比，差異顯著（p<0.01）。 從實驗的結果可以得到以下幾個結論： （1）當單微吸管內(nèi)加入不同濃度的Col IV和LN趨化劑，H

12、CC細胞向趨化液中的偽足生長呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性，和一定的濃度飽和性。當細胞在400 μg/ml Col IV和200 μg/ml LN趨化作用下，其偽足形成達到飽和狀態(tài)，說明趨化液配體與細胞膜上受體結合分子數(shù)達到飽和；而組織胺0.05 ng/ml~500 ng/ml對肝癌細胞無趨化性。當微吸管兩側對于不同濃度的趨化劑，HCC細胞向ColIV和組織胺中偽足的長度隨著組織胺濃度的升高而縮短，在組織胺濃度為5.0 ng/ml，偽足長度最小，

13、抑制顯著，而組織胺側偽足的縮短并未對另側細胞偽足的形成造成明顯的影響。 （2） 當細胞骨架干擾劑細胞松弛素D和鈣離子于ColIV趨化劑作用下，細胞松弛素D的濃度為0.5 μg/ml~2 μg/ml時，Ca2+濃度為1μmol/l~3.0μmol/l時，細胞偽足的生長與控制組相比抑制顯著（P<0.01），并具有濃度依賴性。及光鏡和電鏡下骨架的紊亂無序及溶解，說明細胞骨架干擾劑通過引起胞內(nèi)微絲骨架的解聚而抑制偽足的形成，即細胞骨架是

14、形成偽足的原動力。 （3） 整合素單抗Anti-CD49a~Anti-CD49d處理細胞后，Anti- CD49b、Anti- CD49c(10 μg/ml ，20 μg/ml)對肝癌細胞在IV型膠原趨化運動時偽足的生長與單個單抗作用相比有較強的抑制作用（P<0.01），表明α2 、α3是IV型膠原的效應受體。 （4） 在Boyden小室中偽足在不同濃度的ColIV趨化液作用下呈現(xiàn)明顯的趨化遷移性；細胞松弛素D則主要通過