自然殺傷細(xì)胞在乙型肝炎肝衰竭中的趨化機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　目前乙型肝炎病毒（HBV）在全球約有3.5億感染者,而我國(guó)是世界上乙型肝炎病毒（HBV）感染的高發(fā)地區(qū)之一，且由 HBV感染所引起的慢加急性肝衰竭（HBV-ACLF）是我國(guó)臨床疾病治療中的常見危重疾病，其比例呈上升的趨勢(shì)，該疾病一旦發(fā)生，進(jìn)展迅速，病情危重，因臨床上缺乏特異、有效的治療手段和干預(yù)靶點(diǎn)，且并發(fā)癥多，大部分患者預(yù)后不良，死亡率可達(dá)70％。對(duì)于由乙型肝炎病毒所致的慢加急性肝衰竭的發(fā)生發(fā)展機(jī)制的學(xué)說很多，但目前

2、比較明確的是，病毒和宿主兩個(gè)方面的因素均可影響疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸等。其中的病毒方面包括病毒蛋白、基因多態(tài)性以及變異等與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而宿主方面的基因的多態(tài)性及相關(guān)的免疫學(xué)因素也可以影響該疾病的發(fā)生和發(fā)展的過程。
　　乙肝慢加急性肝衰竭是一個(gè)多因素相互促進(jìn)、相互制約的復(fù)雜過程。免疫細(xì)胞及其分泌的多種細(xì)胞因子、趨化因子和黏附分子積極參與了乙肝肝衰竭發(fā)生、發(fā)展的過程，并在其中發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)已證明抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞（

3、CTL）在肝臟損傷中發(fā)揮重要作用。隨著乙肝肝衰竭發(fā)生機(jī)制的進(jìn)一步深入研究，各種致病因素的作用、相互關(guān)系被逐漸的闡明和應(yīng)用于臨床,前期研究以鼠三型肝炎病毒（MHV-3）誘導(dǎo)的暴發(fā)型肝衰竭小鼠模型為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)了NK細(xì)胞具有向肝臟募集的趨勢(shì)，隨著MHV-3感染時(shí)間的延長(zhǎng)，NK細(xì)胞逐漸活化，在Fas-FasL途徑和NKG2D-NKG2DL途徑的介導(dǎo)下對(duì)感染病毒的肝細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的殺傷作用，闡明了肝臟NK細(xì)胞的作用及機(jī)制，表明了在暴發(fā)型肝衰竭

4、中NK細(xì)胞發(fā)揮的重要作用。
　　此后，為了進(jìn)一步研究NK細(xì)胞導(dǎo)致肝損傷的病理生理的具體過程，應(yīng)用基因芯片技術(shù)，在鼠三型肝炎病毒（MHV-3）誘導(dǎo)的暴發(fā)型肝衰竭小鼠模型模型中，篩選出具有差異表達(dá)的NK細(xì)胞趨化因子受體CCR1、CCR5、CXCR3和CXCR4（表1）。并且，在后續(xù)的研究中證明,在MHV-3誘導(dǎo)的小鼠暴發(fā)性肝衰竭模型中，趨化因子受體CCR5及其相應(yīng)的配體（MIP-1a、MIP-1β及RANTES）在NK細(xì)胞的募集及活化

5、以及隨后的肝衰竭的發(fā)生、發(fā)展中起到了十分重要作用。
　　本研究擬在實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，繼續(xù)探討NK細(xì)胞趨化因子受體CCR5及其配體在乙肝慢加急性肝衰竭發(fā)病過程中在NK細(xì)胞的趨化和募集過程中所發(fā)揮的作用，進(jìn)而為闡述和治療乙肝病毒誘導(dǎo)的肝衰竭的肝損傷發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的：
　　以NK細(xì)胞趨化因子受體CCR5為研究對(duì)象，研究乙型慢加急性肝炎肝衰竭患者中NK趨化機(jī)制。
　　方法：
　　1、建立乙

6、肝慢加急性肝衰竭患者、輕中度慢乙肝患者、及健康對(duì)照的病例對(duì)照研究隊(duì)列。
　　2、利用流技術(shù)細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)乙肝慢加急性肝衰竭患者、輕中度慢乙肝患者及健康對(duì)照外周血的CCR5+NK細(xì)胞數(shù)量，并分析CCR5+NK細(xì)胞數(shù)量與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性。
　　3、通過酶聯(lián)免疫雙抗體夾心法（ELISA）技術(shù)檢測(cè)乙肝慢加急性肝衰竭患者、輕中度慢乙肝患者、及健康對(duì)照外周血血清中CCR5的相關(guān)配體CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP-1β)和C

7、CL5(RANTES)水平。
　　結(jié)果：
　　1、乙肝慢加急性肝衰竭患者的外周血NK細(xì)胞比例顯著下降，為8.558％（8.558±1.324，P=0.0001），與此相反，而其CCR5+NK增加至40.74％（40.74±3.659，P=0.0002），而輕中度慢乙肝患者的外周血的淋巴細(xì)胞中 NK細(xì)胞所占的比例為14.14％（14.14±2.307），其CCR5+NK比例為21.14％(21.14±2.583),與健康對(duì)照相

8、比，其NK細(xì)胞比例無顯著變化（P=0.101）而其CCR5+NK增加不明顯（P=0.3699），而與乙肝慢加急性肝衰竭患者相比其外周血NK細(xì)胞比例顯著增加，（8.558±1.324，P=0.0440），與此相反，CCR5+NK顯著減少（40.74±3.659，P=0.0002）。健康對(duì)照組的外周血的淋巴細(xì)胞中NK細(xì)胞所占的比例為19.19％（19.19±1.823），其CCR5+NK比例為16.75％(16.75±4.029)
　

9、　2、通過流式細(xì)胞分析技術(shù)，可以清楚的區(qū)分出NK細(xì)胞及其亞群，分別檢測(cè)NK細(xì)胞、CD56brightNK細(xì)胞CD56dimNK細(xì)胞中CCR5+NK細(xì)胞的比例,三組的CD56brightNK細(xì)胞中CCR5+NK細(xì)胞均顯著高于CD56dimNK細(xì)胞中CCR5+NK的比例。在乙肝慢加急性肝衰竭患者中，與CD56dimNK細(xì)胞中 CCR5+NK細(xì)胞百分率（37.48±3.985）相比，相同的，在輕中度慢乙肝患者組中，與 CD56dimNK細(xì)胞中

10、CCR5+NK細(xì)胞百分率（16.24±3.855）相比，CD56brightNK細(xì)胞CCR5+NK顯著增加（58.35±7.313，P<0.0001）,CD56brightNK細(xì)胞CCR5+NK顯著增加（65.93±5.135，P<0.0001）健康對(duì)照組的CD56brightNK細(xì)胞中CCR5+NK細(xì)胞比例為40.94％（40.94±6.692）與CD56dimNK細(xì)胞中CCR5+NK細(xì)胞（14.65±3.855）比顯著增多（P=0.

11、0028）。
　　3、乙肝慢加急性肝衰竭患者外周血NK細(xì)胞中CCR5+NK比例與肝損傷嚴(yán)重程度有一定的關(guān)系，尤其與患者的PTA（％）呈正相關(guān)（P=0.0230,R=0.563）,與TBil無明顯相關(guān)性（P=0.1073,R=0.4882），與Dbil無明顯相關(guān)性（P=0.3948,R=0.2707），與ALT（P=0.0684,R=0.566）和AST（P=0.3740,R=0.2822）也無明顯相關(guān)性。
　　4、分別檢測(cè)健

12、康對(duì)照、輕中度慢乙肝患者和乙肝慢加急性肝衰竭患者的外周血中CCR5相關(guān)配體CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP-1β)和CCL5(RANTES)的表達(dá)水平。結(jié)果顯示乙肝肝衰竭患者外周血的CCL3(MIP-1α)的濃度為421.7pg/ml(421.7±60.36),與健康對(duì)照(816.3±167.9)顯著減少（P=0.0339）,其CCL5(RANTES)的濃度為14.39ng/ml(14.39±3.404),與健康對(duì)照(6.15

13、8±0.8748)顯著增高（P=0.0309）。
　　結(jié)論：
　　1、CCR5+NK細(xì)胞在乙肝慢加急性肝衰竭患者、慢乙肝患者和健康對(duì)照之間存在顯著差異,在乙肝慢加急性肝衰竭的外周血中顯著增加，提示CCR5可能在NK的趨化過程中起到作用；
　　2、外周血CD56brightNK細(xì)胞亞群中CCR5+NK細(xì)胞比例高于其在CD56dimNK亞群中的比例，提示分泌型的CD56brightNK可能更多的趨化到肝臟發(fā)揮作用；