鎘致長(zhǎng)江華溪蟹鰓細(xì)胞調(diào)亡的研究.pdf

1、本論文采用急性毒性實(shí)驗(yàn)方法，研究了鎘(Cd2+)對(duì)長(zhǎng)江華溪蟹（Sinopotamonyangtsekiense）鰓組織細(xì)胞凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)置五個(gè)濃度組(7.25、14.50、29.00、58.00和116.00 mg·L-1)和一個(gè)對(duì)照組，處理時(shí)間24、48、72和96 h。首先，利用顯微與亞顯微技術(shù)、吖啶橙和溴化乙錠(AO/EB)雙熒光染色法、原位末端標(biāo)記法(TUNEL)以及瓊脂糖凝膠電泳法，從細(xì)胞形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)水平檢測(cè)了鰓組織細(xì)

2、胞的凋亡。其次，為了探討Cd2+誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑，對(duì)不同濃度Cd2+處理鰓組織48 h，半胱天冬酶-3(caspase-3)、半胱天冬酶-8（caspase-8）、半胱天冬酶-9（caspase-9）活力進(jìn)行了測(cè)定。之后，就Cd2+誘導(dǎo)鰓組織細(xì)胞凋亡的機(jī)制做了進(jìn)一步研究。以不同濃度Cd2+處理48 h檢測(cè)乳酸脫氫酶(LDH)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)活力，以及過氧化氫(H2O2)、羥自由基(·OH)，超氧陰離子(O2-·)含量。

3、另外，在細(xì)胞凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3基因方面也做了初步研究。通過提取鰓組織細(xì)胞總RNA，cDNA第一鏈的合成、特異性引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳以及產(chǎn)物回收，獲得一條核苷酸序列并進(jìn)行了測(cè)序分析。具體結(jié)果如下:
　　(1)經(jīng)Cd2+處理后，顯微與亞顯微觀察檢測(cè)到了典型的細(xì)胞凋亡特征，具體表現(xiàn)為核邊集、核膜折疊、核染色質(zhì)致密濃縮、核裂解形成凋亡小體等現(xiàn)象;瓊脂糖凝膠電泳圖譜出現(xiàn)凋亡細(xì)胞所特有的DNA梯狀條帶。隨著Cd2+

4、濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡細(xì)胞所占比例呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，凋亡指數(shù)的變化表現(xiàn)出顯著的劑量與時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。隨著Cd2+濃度的增加，caspase-3、caspase-9、iNOS活力逐漸升高，且酶活力的增高與凋亡指數(shù)的上升呈正相關(guān)關(guān)系;caspase-8活力較對(duì)照組無顯著性差異，與凋亡指數(shù)變化相關(guān)度較低。
　　(2)處理48 h，隨著Cd2+濃度的增加，凋亡細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組比較均出現(xiàn)了不同程度的增加;LDH活力不斷上升，但是較

5、對(duì)照組差異不顯著;O2-的含量先升后降;·OH含量一直處于被抑制狀態(tài);H2O2含量沒有發(fā)生顯著變化。
　　(3)實(shí)驗(yàn)得到了一條核苷酸序列，經(jīng)分析其中一部分與凡納濱對(duì)蝦Litopenaeusvannamei中caspase-3基因片段相似度極高，另外一部分片段與大腸桿菌Escherichiacoli體內(nèi)的功能蛋白基因即蛋白復(fù)制基因片段相似度極高。處于上下游的兩個(gè)基因片段有重疊部分，經(jīng)分析重疊部分有與啟動(dòng)子相似度極高的核苷酸序列，該基

6、因可能參與了蛋白質(zhì)表達(dá)調(diào)控機(jī)制。
　　結(jié)論:
　　(1)鎘能夠引起長(zhǎng)江華溪蟹鰓組織細(xì)胞凋亡;細(xì)胞凋亡的檢測(cè)以及凋亡指數(shù)的變化能夠靈敏反映鎘對(duì)水生動(dòng)物的脅迫程度及毒性大小，可作為水生態(tài)環(huán)境鎘污染程度的生物指標(biāo)。
　　(2) Cd2+處理48 h，長(zhǎng)江華溪蟹鰓組織細(xì)胞膜發(fā)生了輕微損傷，但是沒有達(dá)到膜內(nèi)物質(zhì)泄漏的程度;活性氧中的三個(gè)重要組成成員可能不是誘發(fā)細(xì)胞凋亡的因素，而可能是一氧化氮介導(dǎo)了氧化脅迫引起的細(xì)胞凋亡。