總dna的提取及pcr技術(shù)講義

1、實驗三實驗三植物總植物總DNADNA的提取的提取一、一、原理原理細胞中DNA主要存在于細胞核內(nèi)，稱為核DNA或染色體DNA，也有人稱之為基因組DNA(genomicDNA)，嚴格地講，基因組DNA是指單倍體細胞核DNA。細胞質(zhì)中含有少量的DNA，稱為核外DNA或核外基因。主要分布在線粒體及葉綠體內(nèi)，分別稱為線粒體DNA(mtDNA)及葉綠體DNA(ctDNA)。細胞內(nèi)各種DNA總稱為總DNA(totalDNA)。根據(jù)實驗需要可分別提取不

2、同的DNA。植物核DNA的提取主要用于基因文庫構(gòu)建、PCR分析及Southern雜交，也可以提取總DNA進行Southern雜交。核DNA分子呈極不對稱的線狀結(jié)構(gòu)，一條染色體為一個DNA分子。高等植物核DNA的分子量為1012左右，約含有109bp，就其長度與直徑的比例而言，是一個極不對稱的分子。如此細長的分子對任何機械力的作用都十分敏感，雖然現(xiàn)在已能夠成功地測定出它的一級結(jié)構(gòu)，但到目前為止，仍無法分離純化出它的完整分子。在分離純化過程

3、中，DNA分子的降解是很難避免的。因而分離純化所得到的只不過是植物核DNA分子的片段。采用不同的分離方法，所得的片段大小有所不同。用于Southern雜交的植物DNA樣品在長度上應(yīng)不小于50Kb。線粒體DNA及葉綠體DNA的分子要小得多，分子量約為107，而且為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，因此完整的線粒體DNA及葉綠體DNA的分離并不十分困難，現(xiàn)已有許多報道。核DNA、線粒體DNA、葉綠體DNA的提取一般是先分離出細胞核及細胞器，然后再提取DNA?？侱N

4、A的提取不必分離細胞核及細胞器，用溫和的方法使細胞破碎后，核蛋白體自然釋放出來。（一）（一）方法概述方法概述植物DNA的制備與動物DNA制備原理大致相同，為獲得高質(zhì)量DNA應(yīng)選取幼嫩組織或組織培養(yǎng)物為材料，由于植物材料中DNase水平低，蛋白質(zhì)含量較少，其操作要點主要是克服植物次生代謝物如多酚、類黃酮和植物多糖對DNA制備的影響。關(guān)于植物總DNA的提取方法有關(guān)文獻報道很多，但從提取原理上看主要有兩種：CTAB法和SDS法。1.CTAB法

5、：法：CTAB(cetyltrimethylammoniumbroe)十六烷基三甲基溴化銨是一種陽離子去污劑，可溶解細胞膜，它能與核酸形成復合物，在高鹽溶液中(≥0.7mol／LNaCl)是可溶的，當降低溶液鹽濃度到一定程度(0.3mol／LNaCl)時，從溶液中沉淀，通過離心就可將CTAB與核酸的復合物同蛋白質(zhì)、多糖類物質(zhì)分開，然后將CTAB與核酸的復合物沉淀溶解于高鹽溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇隨之被除去。CTA

6、B提取緩沖液的經(jīng)典配方中各試劑的作用：CTAB溶解細胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；TrisHCl(pH8.0)提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；NaCl提供一個高鹽環(huán)境，使CTAB與核酸形成的復合物充分溶解，存在于液相中；EDTA螯合Mg2或Mn2離子，抑制DNase活性；β巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，PVPK30（聚乙烯吡喏烷酮）可以降低酚化合物的離子化，使酚容易去除。操作的主要程序是植物材料冷凍研磨成粉后

7、，加入高鹽提取緩沖液，于56℃保溫若干時間，使細胞破碎，核蛋白體解析，蛋白質(zhì)變性。提取液中含有β巰基乙醇可防止材料中的多酚類物質(zhì)氧化。然后用氯仿／異戊醇抽提，去除蛋白類物質(zhì)。若一次抽提效果不理想，可補加少量高鹽、高濃度CTAB溶液，繼續(xù)用氯仿／異戊醇抽提。抽提后的水相，加入不含鹽的CTAB沉淀緩沖液，降低溶液的鹽濃度使核酸與CTAB形成的復合物沉淀，離心收集沉淀植物細胞具有細胞壁，植物總DNA提取時如何在使植物細胞壁有效破碎的同時盡量保

8、持DNA的完整，是提取的重要一環(huán)。許多細胞破碎的方法都會引起DNA嚴重的機械斷裂，因而植物DNA提取時很難在產(chǎn)品的質(zhì)量(長度)及產(chǎn)量之間都達到滿意的結(jié)果。國外文獻中多用冷凍干燥的材料進行提取，因冷凍干燥的材料很容易粉碎，研磨時組織破碎效率高，而且在冷凍干燥狀態(tài)下，DNase活力極低，研磨時不會引起DNA降解。同時，冷凍干燥又是保存植物材料的最好方法，冷凍干燥的材料在脫水的狀態(tài)下貯存幾年，DNA都不會有明顯的變化，可以在植物各個生理狀態(tài)下

9、分別取材，經(jīng)冷凍干燥后保存到需要的時候一同提取DNA。但由于制備冷凍干燥的材料需要凍干機，使這種方法在一般實驗室使用受到限制。1976年國外報道了將植物材料小塊置液氮中冷凍，并在冷凍狀態(tài)下研磨成粉，然后再加入去污劑、蛋白酶等試劑，使細胞充分破碎的方法，效果比較理想。很快，這種植物細胞破碎的方法被廣泛采用。采用這種方法時，操作中應(yīng)注意以下幾個問題：①當植物材料表面或內(nèi)部含有較多水分時，液氮冷凍會形成冰晶而妨礙研磨。所以，在液氮冷凍前，植物

10、材料表面的水分一定要用濾紙吸干。對于含水量大的新鮮植物材料，如某些植物葉片、疏松的愈傷組織，冷凍前用乙醇擦拭，使之部分脫水。②研磨使用的器皿(包括角匙)要在液氮中預(yù)冷，研磨的全過程均應(yīng)在冷凍狀態(tài)下進行，不允許材料在研磨過程中融化，為保持材料的冷凍狀態(tài)。研磨過程中可斷續(xù)向研缽內(nèi)加入液氮，但這種操作常會因添加液氮過猛而使材料被沖散出容器，很難再收集，尤其是在研磨后期很容易發(fā)生，所以要注意輕緩地操作。另外，在液氮中的材料不好研磨，只有在液氮蒸

11、發(fā)殆盡時，才好研磨，所以建議采用將研缽置液氮浴中，斷續(xù)向研缽外添加液氮的作法，可以克服上述問題。③樣品研磨成粉后，在加入提取緩沖液前必須保持其冷凍狀態(tài)，如果融化，內(nèi)源DNase會引起DNA降解，嚴重影響提取效果。DNA降解主要來自提取過程中的物理因素及DNase活性，因此防止DNA降解要從這兩方面出發(fā)。物理因素主要是機械剪切力，溶液在震蕩、攪拌、轉(zhuǎn)移、反復凍融、滲透壓驟變及細胞急劇破裂內(nèi)容物外泄時都會產(chǎn)生強的機械剪切力，因而提取時的各種

12、操作均應(yīng)溫和地進行，避免劇烈振蕩，轉(zhuǎn)移DNA溶液的槍頭要剪去尖部，擴寬管口，吸取過程中避免產(chǎn)生氣泡，盡量避免用反復吸打的方法助溶DNA沉淀等。為防止DNase的降解作用，提取時使用的器具、研缽、離心管、溶液等要經(jīng)過高壓滅菌。由于DNase以Mg2、Ca2二價離子為激活劑，所以在提取液中需加入二價離子螯合劑EDTA來消除外源及內(nèi)源的酶活性。（二）植物總植物總DNADNA提取的實驗設(shè)計提取的實驗設(shè)計1.提取方法選定提取方法選定植物總DNA提

13、取的方法很多，實驗前要根據(jù)植物材料的情況及選用的檢測方法來確定。如果采用PCR擴增鑒定轉(zhuǎn)化體，或先經(jīng)PCR擴增，然后再進行Southern雜交檢測時，可選用快速微量的SDS法，因PCR技術(shù)對DNA樣品量及純度的要求均不高，甚至可以直接用組織勻漿進行擴增，同時又因PCR具很高的靈敏性，為防止試劑交叉污染，應(yīng)盡量減少提取步驟。如果直接采用Southern雜交來鑒定轉(zhuǎn)化體，由于Southern雜交對DNA樣品的數(shù)量及質(zhì)量要求都較高，需要的樣品