毛囊組織dna提取方法的研究

1、藥物性耳聾線粒體12SrRNA基因1555G點突變基因檢測的實驗室技術體系1人頭發(fā)毛囊組織人頭發(fā)毛囊組織DNA提取方法的研究提取方法的研究技術保障與研發(fā)部魏宏泉摘要摘要本研究以人頭發(fā)的毛囊組織為材料，在動物組織總DNA提取的經(jīng)典技術方案基礎上，兼顧效率、成本和產(chǎn)率等三方面因素，對毛囊組織DNA提取方法進行了優(yōu)化，并設計了實用有效的取樣方法。研究結果顯示，可以以少至一根帶毛囊的頭發(fā)為材料，在40分鐘時間內(nèi)獲得約0.5?g組織DNA，其產(chǎn)量

2、和質(zhì)量可以滿足基因檢測工作后續(xù)流程的需要。同時，一次提取過程所耗藥品試劑的成本約為0.3元，大大低于以微量血為材料的試劑盒提取法的成本。在以RFLP法對線粒體12srRNA基因1555位點進行基因檢測的技術體系中，組織DNA提取是實驗室工作的第一步，該工作的效率、質(zhì)量、成本等因素對整體檢測流程具有至關重要的影響。在此之前的研究工作中，我們確定了以微量血為材料提取組織DNA的技術方法，但為了使基因檢測項目的實施具有更強的可操作性，設計多樣

3、化的組織樣本采集形式則是必需的。為此，本研究以人頭發(fā)毛囊組織為材料，旨在建立適用的取樣方法和DNA提取方法的技術體系。1.材料與方法材料與方法人頭發(fā)毛囊組織人頭發(fā)毛囊組織取自健康成年人。取樣方法：用鑷子夾住頭發(fā)根部的部位，順著毛發(fā)生長方向用力一拔即可，此時在毛發(fā)根部應明顯可見白色或半透明的毛囊組織。然后用剪刀剪去大部分的毛干部分，將毛根帶有毛囊組織的部分置于1.5mlEppendf管內(nèi)。試劑配制試劑配制（1）ProteinaseKPro

4、teinaseK用去離子水溶解，濃度20mgml。（2）組織消化液10mMTrisHCl，pH7.510mMEDTA10mMNaCl0.5％SDS（3）LiCl溶液無水LiCl用去離子水溶解，濃度為7.5M。（4）TE溶液10mMTrisHCl，pH7.50.1mMEDTA，pH8.0參考操作程序參考操作程序（1）加入60?l消化液，再加入1?l蛋白酶K溶液，用渦旋混合器震蕩5秒鐘。藥物性耳聾線粒體12SrRNA基因1555G點突變基因

5、檢測的實驗室技術體系32.結果與分析結果與分析2.1頭發(fā)數(shù)量對頭發(fā)數(shù)量對DNA提取結果的影響提取結果的影響以16根頭發(fā)為材料，每組都可以有效提取出基因組DNA，13根頭發(fā)組的DNA產(chǎn)量有較為明顯的隨頭發(fā)數(shù)增多而產(chǎn)量也增多的變化，36根頭發(fā)組的DNA產(chǎn)量則沒有明顯差別。如圖1所示。在圖1顯示的電泳結果中，第1、2、3條帶的亮度逐漸增加，說明隨著頭發(fā)數(shù)的增加其相應的DNA產(chǎn)量也隨之增加，而第3、4、5、6條帶的亮度差異不明顯，說明所獲得的D

6、NA產(chǎn)量基本相同注1。而事實上16根頭發(fā)中所含DNA的量應該是隨頭發(fā)數(shù)量增加而遞增的，出現(xiàn)這種矛盾現(xiàn)象的可能原因是：相同的消化液和蛋白酶K使用量并不適用于處理不同數(shù)量頭發(fā)。在本實驗中，所使用的60?l消化液和1?l蛋白酶K可能是對應于13根頭發(fā)的合適用量，可以達到完全裂解細胞膜和細胞核并釋放DNA的效果，而46根頭發(fā)可能造成了蛋白酶反應底物的過量，這些過量的組織細胞并沒有被裂解，因此所釋放出的總DNA量仍與13根頭發(fā)釋放的DNA量相當。

7、從電泳結果顯示的條帶亮度來看，由于所使用的DNA分子量標準每條帶的亮度約為20ng，因此可以估測認為，本實驗從一根頭發(fā)中提取出的基因組DNA約為400600ng，該產(chǎn)量對于基因檢測的技術實施來說已經(jīng)足夠，完全可以滿足后續(xù)工作的需要。2.2蛋白酶蛋白酶K消化對消化對DNA提取結果的影響提取結果的影響在蛋白酶K反應體系中，組織樣本中細胞的裂解率是受酶促反應時間和酶與底物比例影響的。本實驗中各組均以一根頭發(fā)為材料提取DNA，同時所使用的蛋白酶

8、K適度過量，結果DNA產(chǎn)量出現(xiàn)了隨時間而變化的梯度上升。（1）蛋白酶）蛋白酶K消化時間對消化時間對DNA提取結果的影響。提取結果的影響。注1：DNA條帶的亮度差異包含因不同樣本的毛囊大小不同而導致的DNA產(chǎn)量差異這一因素，本研究中對此差異忽略不計。本研究中各實驗都存在此現(xiàn)象，在此一并說明，后文不再一一注解。Lane1：一根頭發(fā)提取DNA的結果Lane2：二根頭發(fā)提取DNA的結果Lane3：三根頭發(fā)提取DNA的結果Lane4：四根頭發(fā)提取