出凝血檢查

1、實驗 出凝血檢查,上海交通大學醫(yī)學院余文紅,（一）血標本的采取應注意的問題,,,1. PT、APTT凝血實驗檢查均使用靜脈血。采血人員應技術(shù)熟練，以防止組織損傷，外源性凝血因子進入針管。,,2．一般血液采集，進入容器至進行實驗所用的時間越短，所分析的凝血因子被保護得越好。從輸液三通管取出血的做法不可取。,,3．取血時病人應松馳，環(huán)境溫暖，防止靜脈攣縮，止血帶的壓力要盡可能小，取血時，拉針栓的速度要慢而均勻，使血液平穩(wěn)地進入注射器

2、，防止氣泡的產(chǎn)生。,,4．一旦取樣完畢，立即與抗凝劑充分混合，一般提倡使用真空采血管。,,5．用硅化玻璃或塑料注射器采血?？紤]結(jié)果的精確性，應將試管刻度的可能誤差控制在既定體積的10%以內(nèi)。,,6.采血后標本在低溫保存且在一定時間范圍內(nèi)。,,7. 國際血液學標準化委員會（ICSH）、國際血栓與止血委員會（ICTH）推薦使用3.2g/dl（含2H2O）或0.109mol/L的枸櫞酸鈉作為凝血因子檢查的抗凝劑。,,8.抗凝劑在血標本的絕對含

3、量可改變血漿中鈣離子濃度，進而影響試驗結(jié)果，因此應根據(jù)患者紅細胞比例（Hct）狀況隨時調(diào)整抗凝劑用量。,（二）應用試劑應注意的問題,,,1.組織凝血活酶工作制劑的國際敏感指數(shù)（ISI），為了使不同敏感性的組織凝血活酶在檢測PT中能得到同樣的結(jié)果，必須要制定一個共同的敏感性指標。,,2.凝血活酶和部分活化凝血活酶的使用步驟必須嚴格按照說明書進行。通常在使用前必須充分混勻試劑，以使微粒重新均勻懸浮于液體中。,,3.試劑準備過程中應該使用去

4、離子水。,,4.正常對照血漿通常將多份健康人血標本混在一起，以彌補個體誤差。,（三）使用實驗器材應注意的問題,,,1. 玻璃器皿的要求：貯存和測試時應選用干凈、沒有劃痕的試管。,,2. 溫度的要求：人工測定終點法要求水浴箱的溫度必須保持在（37±1）℃，并且周圍照明設備要好，便于讀取終點。,（四）實驗操作應注意的問題,,,1. 許多試驗誤差都來源于技術(shù)的錯誤。在實驗技術(shù)、試劑、溫度及pH值上很微小的變化都會導致試驗結(jié)果明顯的變

5、化。,,2. 手工法PT或試管法CT檢查時，傾斜試管動作一定要輕，角度要小，以減少血液與管壁的接觸面積。,,3. 血液凝固主要是酶催化的反應，所以實驗過程中要嚴格控制理想的pH環(huán)境和溶液的離子強度。,,4. 試驗結(jié)果準確還取決于所用的反應物的量、加入順序和不同反應物的孵育時間。,,5. APTT、PT需乏血小板血漿。,,6. 試驗前檢查血漿是否有溶血、黃疸、脂血和出現(xiàn)凝塊。,7. 報告方式：以PT的秒（s）數(shù)報告。以患者PT（s）/

6、正常對照（s）的比（PTR）報告。在口服藥物治療監(jiān)控時以INR報告。ICSH規(guī)定，不再用百分比（活動度）報告。APTT以秒報告。,1987年WHO提出PT值用INR（international normalized ratio國際標準化比值）作為PT結(jié)果報告形式，并用以作為抗凝治療監(jiān)護的指標。,,,INR=［病人PT（s）/正常人平均PT（s）］ISIPTR=受檢者PT（s）/正常對照PT（s）INR=PTRISIISI：國

7、際敏感指數(shù)（international sensitivity index）1～1.9,,CT、PT、APTT、RT、Fg、TT,凝 血 時 間 測 定,C T,目的：掌握玻璃試管法凝血時間測定的方法,,原理：,離體靜脈血與玻璃表面接觸后，血中XII因子活化并啟動內(nèi)源性凝血途徑，最終生成纖維蛋白而使血液凝固所需的時間。,器材：,6mm直徑玻璃試管3支靜脈采血器材37℃恒溫浴箱秒表,,步驟：3支試管各1ml血，每隔0.5min傾斜

8、，第一管計時后，立即觀察第二、三管并計時，直至血液凝固。結(jié)果判斷：從血液剛進入注射器至第3管凝固所需時間即為凝血時間。,,正常參考值：4～12分鐘報告方式：CT X.Xmin（玻璃試管法）,注意事項：,試管應潔凈干燥，抽血應“一針見血”且血液中不含泡沫。溫度恒定為37℃，傾斜試管角度應在30°左右。,評價：,凝血時間曾用玻片法測定，但由于毛細血管采血，易混入組織液而使凝血時間正常，屬于淘汰方法。延長：嚴重內(nèi)源性凝血

9、途徑凝血因子有缺陷；血中抗凝物質(zhì)增多；肝素治療縮短：高凝狀態(tài)（DIC早期）,凝 血 酶 原 時 間 P T,,原理：,在乏血小板血漿中加入組織因子和鈣離子（鈣凝血活酶）后，血漿發(fā)生凝固的時間即為凝血酶原時間（PT）。,步驟：,取空腹靜脈血1.8ml加入含有0.2ml109mmol/L枸櫞酸鈉的試管中混勻備用?？鼓?000r/min離心10min分離血漿將試劑、正常人混合血漿、待測血漿與37℃預熱5min。血漿0.1ml加入

10、混勻的試劑0.2ml，開動秒表計時。,,正常參考值：PT：11～13秒PTR：1±0.15INR：0.8～1.5,,報告方式：PT：X.Xs，正常人血漿X.XsPTR：X.XINR：X.X,注意事項：,試管應潔凈干燥，抽血應“一針見血”，抗凝劑與血液比例（1：9）應準確。取血后4h內(nèi)完成測定。鈣凝血活酶必須標有國際敏感指數(shù)（ISI），ISI越接近于1.0越敏感。標本測定前應先測定正常人混合血漿，其PT值在允許范

11、圍內(nèi)才能測定樣本。,評價：,血漿凝血酶原是一種篩選試驗，是用來證實先天性或獲得性纖維蛋白原、凝血酶原和凝血因子V、VII、X的缺陷或相應抑制物的存在，也用于監(jiān)測口服抗凝治療時引起的凝血酶原和因子VII、X水平的下降。,實質(zhì)：,對檢測樣本（血漿）中存在凝血激酶時的再鈣化反應，這種過程包括了因子VIIa、組織因子、磷脂、鈣離子對凝血酶原的活化，凝血酶裂解纖維蛋白原和纖維蛋白單體的聚集交聯(lián)。,活化部分凝血活酶時間測定APTT,,原理：,用白

12、陶土激活XII因子、腦磷脂代替血小板磷脂，測定乏血小板血漿加入Ca2++后凝固所需時間。,步驟：,采血 空腹靜脈血1.8ml+0.2ml 109mmol/L枸櫞酸鈉混勻。分離血漿 3000r/min離心10分鐘分離血漿。溶解試劑 臨用時加1ml蒸餾水，室溫靜置15min以上，混勻后使用。預溫活化 0.1ml血漿+APTT試劑0.1ml混勻，37℃準確孵育3min（其間輕輕搖動數(shù)次）加鈣計時 加入0.1ml 25mmol/L C

13、aCl2混勻并立即開動秒表計時，20s后，觀察混合液流動狀態(tài)。,,正常參考值：一般在33.68～40.32s（不同儀器和試劑所測之參考值有差別）報告方式： APTT：XX.Xs，正常人血漿：XX.Xs,注意事項：,采血時穿刺盡量一針見血，不要淤血和氣泡，采血后立即與抗凝劑混合，盡快送往實驗室。使用枸櫞酸鹽（抗凝）血漿 如果不能立即測試，應盡快分離血漿，盛血漿的容器加塞，防止PH值改變血漿在2～8℃下保留7天 鈣凝血活酶必須

14、標有國際敏感指數(shù)（ISI），ISI越接近于1.0越敏感。,臨床意義：,APTT延長：表明有內(nèi)源性凝血途徑有關(guān)因子的缺陷（血友?。┖屠w維蛋白原缺乏。 纖維活力增加，如繼發(fā)性，原發(fā)性纖溶以及血循環(huán)中有纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物（FDP）。 血循環(huán)中有抗凝物質(zhì)。,,APTT縮短：　　　 高凝狀態(tài)，如DIC的高凝期，促凝物質(zhì)進入血液以及凝血因子的活性增高等。,評價：,APTT和PT同時檢測是目前二期止血缺陷的主要篩選試驗組合。,在有臨床出血

15、癥狀的前提下：,APTT PT 提示正常 延長 因子VII的缺陷延長 正常 因子VIII、IX、XI缺陷正常 正常 懷疑因子XIII缺陷可能延長 延長 除因子II、V、I、X缺陷 外，主要是異?？鼓镔|(zhì) 的增多,,,,,血漿復鈣時間RT,,原理：,在去鈣離子的抗凝血漿中，重新加入適量的鈣后，血漿發(fā)生凝固。,步驟：,0.2ml 0.1mol

16、/L草酸鈉+靜脈血1.8ml混勻，離心分離血漿。0.1ml血漿置37℃水浴中，+0.025mol/L CaCl2 0.1ml，立即開動秒表記錄時間。,,正常參考值： 2.08±0.49分（2.18~3.77分鐘）,注意事項：,不要溶血，否則時間縮短CaCl2新鮮配制分離血漿以1000轉(zhuǎn)/分為宜，高速離心可使大量血小板下沉而導致復鈣時間延長。,復鈣交叉時間RT,,步驟：,按下列比例準備5份待測血漿：加樣量

17、 1 2 3 4 5受檢血漿（ml）－ 0.01 0.05 0.09 0.10正常血漿（ml）0.10 0.09 0.05 0.01 －上述試管，置37℃ 1min，加0.025mol/LCaCl2 0.1ml，混勻后，記錄血漿凝固時間。,,,,注意事項：,所用血漿均為富含血小板血漿，分離出血漿后需在2h內(nèi)檢測完畢。,臨床意義：,RT最早作為內(nèi)源性凝血系統(tǒng)相關(guān)凝血因子缺陷的篩

18、選檢查，但由于這個試驗不如APTT，又容易受血小板數(shù)量和功能影響，目前只用來篩選是否存在病理性抗凝物質(zhì)增多。,,延長的復鈣時間如被1/10量的正常血漿所糾正，則表示受檢血漿中缺乏內(nèi)源凝血因子；如不被少量正常血漿糾正，提示存在異常抗凝物質(zhì)。,血漿纖維蛋白原Fg,,,纖維蛋白原的測定方法眾多，大體上分三大類：基于經(jīng)加凝血酶后，形成纖維蛋白的方法，即可凝固蛋白法。物理、化學測定法。免疫學測定法。,目的和原理,,,為了解凝血途徑最后環(huán)節(jié)

19、的狀況，排除纖維蛋白原減少、異常對凝血篩選試驗的影響，了解纖溶活動度等可選擇本試驗。,,Clauss法以凝血酶作用于受檢血漿中的纖維蛋白原，使其形成纖維蛋白，血液凝固。,,纖維蛋白原的量與凝固時間成負相關(guān)，檢測結(jié)果與參比血漿制成的標準曲線對比可得出纖維蛋白原的含量。,步驟：,將參比血漿用血漿稀釋液作原倍、1：2、1：4、1：8、1：16稀釋5管。取稀釋血漿0.2ml于小試管中，置37℃水浴預熱2分鐘，再加凝血酶溶液0.1m

20、l，記錄時間。,,,,,,,,,,相關(guān)分析：,首先先清除內(nèi)存。INV+AC，濃度（log或In）XD，YD輸入（如不取對數(shù)，濃度直接輸入XD，YD 讀取值DATA輸入；全部數(shù)據(jù)輸入完畢，按INV+9讀出相關(guān)系數(shù)r。待測讀數(shù)INV+log或In→讀出相關(guān)濃度。如不取對數(shù)，待測讀數(shù)直接INV+?x→讀出相關(guān)濃度。最終濃度需根據(jù)樣品稀釋倍數(shù)乘積。,^,標準曲線：,t（s）2520151050 0.5

21、 1 1.5 2 2.5C（g/L）,,,,,,,,,,,,,,,如血漿纖維蛋白原含量大于4 g/L時，應稀釋血漿后重測，結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。低于0.8 g/L時，需將原血漿改為1∶2或1∶5稀釋，在標準曲線上查得結(jié)果后，除以5或除以2。,,正常參考值： 2～4mg/ml,臨床意義：,纖維蛋白原增高除生理情況下的應激反應、妊娠后期外，主要出現(xiàn)感染、灼傷、動脈粥樣硬化、急性心肌梗死、

22、多發(fā)性骨髓瘤、糖尿病、敗血癥等。纖維蛋白原減少見于DIC、原發(fā)性纖溶亢進癥、重癥肝炎、肝硬化和溶栓治療時。,評價：,Clauss方法測定的是纖維蛋白原功能，因此需纖維蛋白原結(jié)構(gòu)正常，且有一定的含量，對低（無）纖維蛋白原血癥和因此后纖維蛋白原血癥應改用ELISA和RIA等免疫檢測手段。,主要誤差來源：,血漿稀釋不準。凝血酶活性不足或失效。凝血酶一般應在低溫保存，稀釋后在塑料(聚乙烯)試管中，置4℃可保存活性24小時。測定終點觀察不準

23、確，尤其是纖維蛋白原含量高時，往往很快即凝固，手工法重復性較差，不易做準。,血漿凝血酶時間TT,,原理,以標準凝血酶溶液加入受檢血漿，使凝血酶裂解血漿中的纖維蛋白原，形成纖維蛋白，造成血漿凝固，此時所需時間為凝血酶時間。,方法：,0.1ml血漿+0.1mlTT試劑，37℃水浴中觀察凝固時間。,正常參考值：,16~18S,評價：,時間大于正常參考值3秒：DIC、肝臟病變。,,TT時間縮短，并不代表高凝狀態(tài)或DIC前期，是技術(shù)原因。如操作失