黃曲霉毒素檢測匯總

1、主講教師：朱洪梅,二、食品中霉菌毒素檢驗Detection of Mycotoxin in food,主講教師：朱洪梅,（一）概述 (outline),1 霉菌（molds）霉菌是真菌的一部分，指菌絲體較發(fā)達而沒有較大子實體的真菌。,主講教師：朱洪梅,,真菌（fungi）是一類有細胞壁，不含葉綠素，無根莖葉有菌絲體或單細胞，以寄生或腐生的方式生存，能進行有性或無性繁殖的生物。,主講教師：朱洪梅,2.霉菌的生物學(xué)特性,水分：Aw30

2、℃生長不好 基質(zhì)：營養(yǎng)來源主要是糖和少量氮、礦物質(zhì)。 不同基質(zhì)霉菌生長產(chǎn)毒均受影響,主講教師：朱洪梅,與食品衛(wèi)生關(guān)系密切的六大霉菌,曲霉菌屬青霉菌屬鐮刀菌屬根霉、毛霉、交鏈孢霉等。,主講教師：朱洪梅,霉菌毒素（Mycotoxin）指少數(shù)霉菌在污染食品上繁殖所產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，它對人、牲畜引起損害。,主講教師：朱洪梅,3. 霉菌產(chǎn)毒的特點,1） 霉菌中僅少數(shù)菌種能夠產(chǎn)毒，

3、霉菌只有一部分菌株可以產(chǎn)毒。2）霉菌產(chǎn)毒具有可變性3) 產(chǎn)毒的菌種所產(chǎn)生的霉菌毒素無嚴 格專一性4）產(chǎn)毒霉菌產(chǎn)生毒素需一定條件。,主講教師：朱洪梅,4. 常見霉菌和霉菌毒素名稱,曲霉菌屬：黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、 雜色曲霉毒素青霉菌屬：黃綠青霉素、島青霉素、黃天 精、桔青霉毒素鐮刀菌屬：單端孢

4、霉稀族化合物、玉米赤霉稀酮、 丁稀酸內(nèi)酯、串珠鐮刀菌毒素,主講教師：朱洪梅,5.霉菌及其毒素污染的衛(wèi)生學(xué)意義,霉菌：A．食品使用價值降低或喪失； B. 人類中毒霉菌毒素中毒： 無傳染性、有明顯地方性和季節(jié)性 中毒表現(xiàn)：急性中毒、 慢性中毒 致畸、致癌、致突變,主講教師：朱洪梅,食品中霉菌污染有一定菌相,黃曲霉毒素：

5、 玉米、花生等青霉和毒素： 大米、水果等鐮刀菌及毒素：小米、玉米等,主講教師：朱洪梅,展青霉素的污染,主要污染水果及水果制品,主講教師：朱洪梅,主講教師：朱洪梅,6. 霉菌污染食品質(zhì)量的評定及食品衛(wèi)生意義,1)  霉菌菌相構(gòu)成田野霉：新鮮，交鏈孢霉素曲霉、青霉:可檢毒素，但不表示變質(zhì)毛霉、根霉：糧食霉變2) 霉菌的污染度：即單位重量或容積的食品或100粒糧食上霉菌總數(shù)，表示食品帶染霉菌情況 。,主講教師

6、：朱洪梅,（二）黃曲霉毒素 (aflatoxin, AF),1. AF 的來源2. AF 的化學(xué)結(jié)構(gòu)3. AF的理化性質(zhì)4. AF 的毒性特點5. AF對食品的污染6. 預(yù)防措施,主講教師：朱洪梅,1. AF 的來源,黃曲霉 （Aspergillus flavus） 部分產(chǎn)毒寄生曲霉(Aspergillus parasitlas ) 所有菌

7、株產(chǎn)毒,主講教師：朱洪梅,主講教師：朱洪梅,主講教師：朱洪梅,2. AF的化學(xué)結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)類似，有二呋喃環(huán)、香豆素（雜氧萘鄰?fù)?，毒性與結(jié)構(gòu)有關(guān)：二呋喃環(huán)末端有雙鍵者，毒性強，有致癌性。,主講教師：朱洪梅,主講教師：朱洪梅,3. AF的理化性質(zhì),1) 黃色結(jié)晶，不溶于水，溶于氯仿、甲 醇而不溶于正己烷，石油醚，乙醚2) 在紫外光照射下，產(chǎn)生強熒光3) 耐熱 280℃裂解4) 堿性條件下香豆素形成香豆素鈉鹽溶

8、 于水,主講教師：朱洪梅,4. AFB1 毒性,（1）急性毒性 AFB1是一種毒性極強的劇毒物，最敏感的動物是鴨雛。LD500.24mg/Kg,12μg/只。急性毒作用：肝臟毒,主講教師：朱洪梅,,,AFB1與其它毒物的LD50,主講教師：朱洪梅,（2）慢性毒性,A 肝組織學(xué)變化：肝細胞變性，壞死，再生結(jié) 節(jié)，肝管上皮增生及肝纖維化、肝硬化 B 肝功能變化：血

9、清轉(zhuǎn)氨酶，ATP ，堿性磷 酸酶，球蛋白升高C 其它癥狀：生長發(fā)育遲緩，體重下降，食物利用率降低，母畜不育或產(chǎn)仔 少等。,主講教師：朱洪梅,（3）致癌性,* 最強的化學(xué)致癌劑多種動物誘發(fā)腫瘤：肝癌、 胃癌、腎癌……,主講教師：朱洪梅,AFB1 對大鼠致癌性,

10、,主講教師：朱洪梅,(4）AF 對人類毒性,A．人體細胞體外試驗：抑制細胞分裂、DNA合 成、染色體破碎B．人類急性中毒：非洲、印度、中國等均有 攝入AF污染食品中毒報道 2004年5月肯尼亞40人食用AF污染玉米中毒死亡C．人類肝癌流行病學(xué) AF污染程度與人群肝癌發(fā)病率死亡率正相關(guān) AF增加乙肝患者肝癌發(fā)病率,主講教師：朱洪梅,黃曲霉毒素攝入量與原發(fā)性肝癌發(fā)病率,,主講教師：朱洪梅,扶綏不同地區(qū)

11、肝癌死亡率與主糧中AFB1污染的比較 （1972 – 1980年）,,主講教師：朱洪梅,AF在體內(nèi)代謝和生化作用,A.分布:AF進入體內(nèi)主要分布于肝臟 B.代謝： 羥化（解毒過程） 脫甲基 環(huán)氧化（毒性、致癌性增強） B1、M1、G1的二呋喃環(huán)雙鍵，易發(fā)生環(huán)氧化反應(yīng)，形成2，3－環(huán)氧化物，與DNA的鳥嘌呤發(fā)生加成反應(yīng)，使DNA損傷―致突變致癌。,,主講教師：朱洪梅,主講教師：朱洪梅,

12、5.對食品的污染情況,主要污染糧油及其制品 花生、玉米及其制品污染最嚴重 高溫高濕地區(qū)污染嚴重，南方食品中檢出 率高于北方,主講教師：朱洪梅,6.預(yù)防措施,6.1 防霉：最根本措施，預(yù)防食品被霉菌污染 A 田間耕作，防蟲、晾曬及時 B 貯藏：控制水分 糧食的安全水分 70% 除氧：增加倉中N2，CO2 C 化學(xué)方法：藥物防霉,主講教師：朱洪梅,

13、6.預(yù)防措施,6.2. 去毒： 挑選霉粒物理方法: 加水搓洗 化學(xué)方法： 加堿處理法 二甲基乙醚去油脂中的AFB1新方法：高壓破壞、臭氧、微生物去毒,,,主講教師：朱洪梅,7.食品中限量標準,制訂食品衛(wèi)生標準玉米、花生仁及花生油 <20ppb大米

14、、其他食用油 <10ppb其他糧食、豆類、發(fā)酵制品 <5ppb嬰兒代乳品不得檢出,主講教師：朱洪梅,食品中黃曲霉毒素B1的允許量標準,主講教師：朱洪梅,蘋果和山楂制品中展青霉素限量衛(wèi)生標準,,主講教師：朱洪梅,（三）食品中黃曲霉毒素測定  黃曲霉毒素是一組化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的化合物，目前已分離鑒定出12種，包括B1、B2、Gl、G2、Ml、M2、Pl、Q、H

15、1、GM、B2和毒醇。黃曲霉毒素的基本結(jié)構(gòu)為二呋喃環(huán)和香豆素，B1是二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌?。即含有一個雙呋喃環(huán)和一個氧雜萘鄰?fù)?香豆素)。前者為基本毒性結(jié)構(gòu)，后者與致癌有關(guān)。M1是黃曲霉毒素B1在體內(nèi)經(jīng)過羥化而衍生成的代謝產(chǎn)物。黃曲霉毒素的主要分子形式含B1、B2、G1、G2、M1、M2等。其中M1和M2主要存在于牛奶中。B1為毒性及致癌性最強的物質(zhì)。在紫外線下，黃曲霉毒素B1、B2發(fā)藍色熒光，黃曲霉毒素G1、G2發(fā)綠色熒光。,主講

16、教師：朱洪梅,黃曲霉毒素的相對分子量為312～346。難溶于水，易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有機溶劑，但不溶于石油醚、己烷和乙醚中。一般在中性溶液中較穩(wěn)定，但在強酸性溶液中稍有分解。 在pH9—10的強堿溶液中分解迅速。其純品為無色結(jié)晶，耐高溫，黃曲霉毒素B1的分解溫度為280℃，紫外線對低濃度黃曲霉毒素有一定的破壞性。,主講教師：朱洪梅,1薄層層析法 薄層層析是在黃曲霉毒素研究方面應(yīng)用最廣的分離技術(shù)。自1990

17、年，它被列為AOAC(association of official agricultural chemists)標準方法，該方法同時具有定性和定量分析黃曲霉毒素的功能。。,主講教師：朱洪梅,1.1 原理,本法是利用樣品中的黃曲霉毒素B1，經(jīng)有機溶劑提取、凈化、濃縮、薄層分離后，在波長365nm紫外光下產(chǎn)生藍紫色熒光，根據(jù)其在薄層上顯示熒光的最低檢出量來測定黃曲霉毒素B1的含量。 薄層色譜法黃曲霉毒素B1的最低檢出量為0．00

18、0 4 µg，最低檢出濃度為5 µg／Kg。,主講教師：朱洪梅,1.2 儀器和試劑 (1)儀器 小型粉碎機、樣篩、電動振蕩器、玻璃濃縮器、玻璃板5cm×20cm、薄層板涂布器、展開槽(25cm×6cm×4cm)、紫外光燈100一125w、波長365nm濾光片、微量注射器(2)試劑 ①三氯甲烷、正己烷(沸程30～60℃)或石油醚(沸程60～90℃)、甲醇、苯、乙腈、無

19、水乙醚或乙醚經(jīng)無水硫酸鈉脫水、丙酮。以上試劑在試驗前需先進行空白試驗，如不干擾測定即可使用，否則需逐一進行重蒸。,主講教師：朱洪梅,主講教師：朱洪梅,②硅膠G(薄層色譜用)、三氟乙酸、無水硫酸鈉、氯化鈉、苯一乙腈(98+2)混合液、甲醇水溶液(55+45)。 ③黃曲霉毒素B1標準液：準確稱取1～1.2mg AFTB1標準品，先加入2mL乙腈溶解后，再用苯稀釋至100mL，避光、于冰箱4℃保存。此標準液濃度約為10 µg／mL

20、。先用紫外分光光度計測定其濃度，再用苯一乙腈混合液調(diào)整其濃度為準確10.0 µg／mL。在350nm，AFTB在苯一乙腈(98+2)混合液中的摩爾消光系數(shù)為19 800 .,主講教師：朱洪梅,④黃曲霉毒素B：標準使用液 I液(1.0ug／mL)：取1mL AFTB標準液(10.0ug／mL)于10mL容量瓶中，用苯一乙腈混合液稀釋、定容。 Ⅱ液(0.2ug／mL)：取I液1mL，按上法定容5mL。 Ⅲ液

21、(0.04ug／mL)：取液Ⅱ1mL，按上法定容5mL。,主講教師：朱洪梅,⑤次氯酸鈉溶液(消毒用)：取100g漂白粉，加入500mL水，攪拌均勻。另將80g工業(yè)用碳酸鈉(Na2CO3·H2O)溶于500mL溫水中。將兩液合并、攪拌、澄清、過濾。此液含次氯酸25g／L。污染的玻璃器皿用次氯酸鈉溶液浸泡可達到去毒的效果。,主講教師：朱洪梅,3.1.3操作步驟 (1)樣品處理 樣品從大樣經(jīng)粗碎及連

22、續(xù)多次用四分法縮減至0.5～l kg后全部粉碎。糧食樣品全部通過20目篩，花生樣品全部通過10目篩、混勻。,主講教師：朱洪梅,(2)提取,稱取20.00 g經(jīng)粉碎樣品，置于250 mL具塞錐形瓶中，加30 mL正己烷或石油醚和100 mL甲醇水清液，瓶塞上涂一層水、蓋嚴防漏。振蕩30 min，靜置片刻，以疊成折疊式的快速定性濾紙過濾于分液漏斗中，待下層甲醇水溶液分清后，放出甲醇水溶液于另一具塞錐形瓶內(nèi)。取20.00 mL甲醇水溶液(相當

23、于4.0g樣品)置于另一125 mL分液漏斗中，加20mL三氯甲烷，振搖2 min、靜置分層，如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，可滴加甲醇促使分層。,主講教師：朱洪梅,放出三氯甲烷層，經(jīng)盛有約10g預(yù)先用三氯甲烷濕潤的無水硫酸鈉的定量慢速濾紙，過濾于50mL蒸發(fā)皿中，再加5mL三氯甲烷于分液漏斗中，重復(fù)振搖提取，三氯甲烷層一并濾于蒸發(fā)皿中，最后用少量三氯甲烷洗過濾器，洗液并于蒸發(fā)皿中。將蒸發(fā)皿放在通風柜，于65℃水浴上通風揮干，然后于冰盒上冷卻2～3mi

24、n后，準確加入1mL苯一乙腈混合液。用帶橡皮頭的滴管的管尖將殘渣充分混合，若有苯的結(jié)晶析出，將蒸發(fā)皿從冰盒上取出，繼續(xù)溶解、混合，晶體即消失，再用此滴管吸取上清液轉(zhuǎn)移于2mL的具塞試管中。,主講教師：朱洪梅,(3)測定 ①單向展開法 a．薄板制備：稱取3g硅膠G，加2～3倍量的水，研磨1～2min呈糊狀后，倒人涂布器推成5cm×20cm，厚度約0.25mm的薄層板3塊。在空氣中干燥15min，在100℃活化2h

25、，取出，放干燥器中保存。一般可保存2～3d，若放置時間較長，可再活化后使用。 b．點樣：將薄板邊緣附著的吸附劑刮凈，在距薄層板下端3cm的基線上用微量注射器或血紅素吸管滴加樣液。一塊板可滴加4個點，點距邊緣和點間距為lcm，點直徑約3mm，在同一板上滴加點的大小應(yīng)一致，滴加時可用吹風機用冷風邊吸邊加。,主講教師：朱洪梅,滴加樣式如下：,第一點：10μL AFTB，標準使用液(0.04μg／mL)。 第二點：20μL樣液。第三

26、點：20μL樣液+10μL 0.04μg／mL AFTBl標準使用液。第四點：20μL樣液+10μL 0. 2μg／m L AFTB標準使用液。,主講教師：朱洪梅,,②展開與觀察 在展開槽內(nèi)加10mL無水乙醚，預(yù)展12cm，取出揮干。再于另一展開槽內(nèi)加10mL丙酮一三氯甲烷(8+92)，展開10～12cm，取出，在紫外光下觀察結(jié)果，方法如下：,主講教師：朱洪梅,a．由于樣液上加滴了AFTB1標準，可使AFTB1標準點與樣液中AFTB

27、1熒光點重疊。若樣液為陰性，薄板上第三點AFTB1為0．0 4μg，可用作檢查樣液中AFTB1最低檢出量是否正常出現(xiàn)；若樣液為陽性；則起定性作用。薄層板上第四點AFTB1標準為0. 2 μg．主要起定位作用。 b．若第二點與AFTB1標準點的相應(yīng)位置上無藍色熒光點，則表示樣品中AFTBl含量<5ug／kg；若在相應(yīng)位置上有藍色熒光點，則須進行確證試驗。,主講教師：朱洪梅,③確證試驗 為確認薄層樣上樣液熒光系由黃曲霉毒素B

28、1產(chǎn)生的，加滴三氟乙酸，產(chǎn)生AFTB1的衍生物，展開后此衍生物的比移值在0.1左右。于薄層板左邊依次滴加兩個點。 第一點：10uL 0．04ug／mL AFTBl標準使用液。 第二點：20／μL樣液于以上兩點各加一小滴三氟乙酸蓋于其上，反應(yīng)5min后，用吹風機吹熱風2min(板上溫度不高于40℃)，再于薄層板上滴加以下兩點。 第三點：10uL 0.04ug／mL AFTBl標準使用液。第四點：20μL樣液。

29、 按上法展開并觀察，樣液是否產(chǎn)生與AFTB1標準點相同的衍生物。未加三氟乙酸的三、四兩點，可依次作為標準與標準的衍生物空白對照。,主講教師：朱洪梅,④稀釋定量：樣液中的AFTB1熒光點的熒光強度，如與AFTB1。標準點最低檢出量(0.00 04μg)的熒光強度一致，則樣品中AFTB1含量為即為5ug／kg． 若樣液中熒光強度比最低檢出量強，則根據(jù)其強度估計，減少滴加微升數(shù)，或?qū)右合♂尯笤俚渭硬煌⑸龜?shù)，直至樣液的熒光強度

30、與最低檢出量的熒光強度一致為止。滴加式樣如下： 第一點：l0uL AFTB1，標準使用液(0.04ug／mL)。 第二點：根據(jù)情況滴加10uL樣液。 第三點：根據(jù)情況滴加15uL樣液。 第四點：根據(jù)情況滴加20uL樣液。,主講教師：朱洪梅,4)結(jié)果計算 X = 0.0004×式中：X 一 樣品中AFTBl的含量，ug／kg； V1一加入苯一乙腈混合液的體積

31、，mL； V2—出現(xiàn)最低熒光時滴加樣液的體積，mL； D一樣液的總稀釋倍數(shù)； m1—加入苯一乙腈混合液溶解時相當樣品的質(zhì)量，g；0.0004—AFTBl的最低檢出限量，ug。,主講教師：朱洪梅,2．雙向展開法2.1 原理 如用單向展開法后，薄層色譜由于雜質(zhì)干擾掩蓋了AFTB1的熒光強度，需采用雙向展開法。薄層板先用無水乙醚做橫向展開，將干擾的雜質(zhì)展至樣液點的一邊，而AFTB1不動

32、，然后再用丙酮一三氯甲烷(8+92)做縱向展開，樣品在相應(yīng)處的雜質(zhì)底色大量減少，因而提高了方法的靈敏度。,主講教師：朱洪梅,2.2操作步驟,(1)點樣：取薄層板三塊，在距下端3cm基線上，在距左邊緣0．8～1cm，各滴加10uL AFTB1(0.04ug／mL)標準液，在距左邊緣2.8～3cm處，各滴加20uL樣液。然后在第二塊板的樣液點上滴加l0uL AFTBl(0.04ug／mL)標準液，在第三塊板的樣液點上滴加10uL AFTB1

33、(0.02ug／mL)標準液。,主講教師：朱洪梅,(2)展開： a．橫向展開：在展開槽內(nèi)的長邊置一玻璃支架，加10mL無水乙醇，將上述點好的薄層板靠標準點的長邊，置于展開槽內(nèi)展開，展至板端后，取出揮干。根據(jù)情況，需要時，可再重復(fù)l～2次。 b．縱向展開：揮干的薄層板以丙酮一三氯甲烷(8：92)展開至10～12cm為止。丙酮與三氯甲烷的比例，根據(jù)不同條件自行調(diào)節(jié)。,主講教師：朱洪梅,,,主講教師：朱洪梅,(3)觀察與評定結(jié)

34、果：,a．在紫外光下觀察第一、二塊板，若第二塊板在AFTB1標準點的相應(yīng)處出現(xiàn)最低檢出量，而在第一板與第二板的相同位置上未出現(xiàn)熒光，則樣品中AFTBl含量<5ug／kg。,主講教師：朱洪梅,b．若第一塊板與第二塊板的相同位置上出現(xiàn)熒光點，則將第一塊板與第三塊板比較，這第三塊板上第二點與第一塊板上第二點的相同位置上的熒光點是否與AFTB1標準點重疊，如果重疊，再進行確證試驗。在具體測定中，三塊板可以同時做，也可按順序做。當?shù)谝粔K板出

35、現(xiàn)陰性時，第三塊板可以省略，如第一塊板為陽性，則第二塊板可省略，直接做第三塊。,主講教師：朱洪梅,(4)確認試驗：另取薄層板二塊，于第四、五兩板距左邊緣0.8～1cm處，各滴加10u LATTB1(0.04ug／mL)標準液及一小滴三氟乙酸；在距左邊緣2.8～3cm處，于第四板滴加20uL樣液及一小滴三氟乙酸；于第五板滴加20gL樣液、10uL。AFTBl(0.04ug／mL)標準液及一小滴三氟乙酸，反應(yīng)5min后，用熱風吹2min(板

36、上溫度不高于40℃)。再用雙向展開法展開后，觀察樣液是否產(chǎn)生與AFTB1標準點重疊的衍生物。觀察時，可將第一板作為樣液的衍生物空白板。若樣液AFTB1含量較高時，則將樣液稀釋后，按單向展開法中(4)做確認試驗 .,主講教師：朱洪梅,(5)稀釋定量： 若樣液中AFTBl含量較高，可按單向展開法中(5)稀釋定量操作。若AFTB1含量較低，稀釋倍數(shù)小，在定量的縱向展開板上仍有雜質(zhì)干擾，影響結(jié)果判斷，可將樣液再做雙向展開法測定，

37、以確定含量。,主講教師：朱洪梅,,2.3 結(jié)果計算 同單向展開法。2.4 說明及注意事項 用過后受污染的玻璃器皿，應(yīng)經(jīng)次氯酸溶液(25g／L)，浸泡消毒后再清洗之。,主講教師：朱洪梅,3 酶聯(lián)免疫吸附法:,1996年，Nakane 建立了辣根過氧化物酶標記抗體的測定技術(shù)。由于該方法簡便、敏感、特異，可作為多種抗原或抗體的測定，20世紀70年代后期，該方法引入真菌毒素的檢測中，下面介紹的是競爭性酶聯(lián)免疫吸附間

38、接法檢測黃曲霉毒素B1。,主講教師：朱洪梅,原 理:,將已知抗原吸附在固態(tài)載體表面，洗除末吸附抗原，加入一定量抗體與待測樣品(含有抗原)提取液的混合液，競爭培養(yǎng)后，在固相載體表面形成抗原抗體復(fù)合物。洗除多余抗體成分，然后加入酶標記的抗球蛋白的第二抗體結(jié)合物，與吸附在固體表面的抗原抗體結(jié)合物相結(jié)合，再加入酶底物。在酶的催化作用下，底物發(fā)生降解反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)，通過酶標檢測儀測出酶底物的降解量，從而推知被測樣品中的抗原量。,主講教師：朱