HPLC法檢測(cè)干酪中黃曲霉毒素M1及生物胺.pdf

1、干酪是由牛奶經(jīng)發(fā)酵制成的一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高的食品。近年來(lái)由于我國(guó)人民生活水平提高，干酪的人均消費(fèi)量也在逐年增加。但是，干酪在制作、成熟過(guò)程中由于原料、工藝參數(shù)控制等原因易產(chǎn)生危害人體健康的生物毒素，其中生物胺和黃曲霉毒素M1(AFM1)是干酪中較常見(jiàn)的兩類生物毒素，對(duì)人體的危害較大。針對(duì)這兩種毒素國(guó)內(nèi)外許多研究者也建立了多種檢測(cè)的方法，但是這些方法都不同程度的存在檢測(cè)靈敏度低，耗時(shí)長(zhǎng)，成本高，對(duì)檢測(cè)儀器設(shè)備硬件要求過(guò)高等問(wèn)題。因此，本研究

2、從干酪樣品前處理，柱前衍生化處理，液相色譜檢測(cè)條件幾個(gè)方面著手，針對(duì)干酪中的這兩類生物毒素的檢測(cè)建立方法，以解決這些問(wèn)題。本研究得到以下結(jié)果:
　　 (1)干酪中生物胺HPLC檢測(cè)的研究結(jié)果:
　　 1分別采用三氯乙酸、高氯酸、鹽酸、無(wú)水乙醇，無(wú)水甲醇提取干酪樣品中的生物胺并計(jì)算6種生物胺的添加回收率以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。試驗(yàn)結(jié)果表明，采用鹽酸對(duì)干酪樣品中的生物胺進(jìn)行提取，六種生物胺的總體回收率最高，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于6.7％

3、，提取效果最好。
　　 2選擇丹磺酰氯(Dns-Cl)作為衍生劑，通過(guò)試驗(yàn)確定5mg/ml的丹磺酰氯溶液的最適用量為1ml。
　　 衍生反應(yīng)完成后，因其中含有無(wú)機(jī)鹽等雜質(zhì)，為了避免在色譜檢測(cè)中色譜柱受到雜質(zhì)損害，以及保障生物胺檢測(cè)的精確度。需要對(duì)所得的生物胺衍生物進(jìn)行富集純化。通過(guò)對(duì)比ODS-C18固相萃取方法與乙酸乙酯、乙醚、三氯甲烷三種液-液萃取方法所得的六種生物胺的回收率以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，確定ODS-C18固相萃取

4、的方法最為適宜，并且操作方法更為簡(jiǎn)便。通過(guò)試驗(yàn)確定固相萃取小柱采用15％的丙酮-水溶液作為雜質(zhì)淋洗液，生物胺衍生物洗脫溶劑為5mL的乙腈。在10min之內(nèi)完成生物胺衍生物的固相萃取過(guò)程。
　　 3確定了HPLC-FD測(cè)定干酪中六種生物胺的最佳流動(dòng)相組合為乙腈和水;梯度洗脫，在25min內(nèi)乙腈濃度從30％升到100％。在25min內(nèi)完成組胺、酪胺、色胺、腐胺、尸胺、β-苯乙胺的分析.6種生物胺在上述條件下分離效果良好。
　　

5、 在0.1～10mg·L-1的濃度線性范圍內(nèi)組胺的平均回收率為85.1％～90.3％;對(duì)β-苯乙胺的平均回收率為78.2％～82.6％;其余4種生物胺的平均回收率均超過(guò)92％。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.7％～6.7％。色胺的最低檢出0.0052mg·L-1;組胺為0.0037 mg·L-1;酪胺為0.0158 mg·L-1;β-苯乙胺為0.0063 mg·L-1;尸胺為0.0072 mg·L-1;腐胺為0.0182 mg·L-1.本

6、方法從樣品處理到最后完成6種生物胺的色譜分析，需要80～90min，對(duì)比現(xiàn)行國(guó)標(biāo)的分析時(shí)間(150～200min)，檢測(cè)速度提高了一倍。綜上所述，本方法是一種檢測(cè)干酪樣品中6種生物胺的既快速又準(zhǔn)確的方法。
　　 (2)干酪中黃曲霉毒素M1 HPLC檢測(cè)的研究結(jié)果:
　　 1分別采用乙睛、甲醇、丙酮提取干酪樣品中的AFM1，對(duì)待測(cè)干酪樣品進(jìn)行預(yù)處理，并計(jì)算AFM1的添加回收率以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。試驗(yàn)結(jié)果表明采用乙睛對(duì)干酪樣品

7、中的AFM1進(jìn)行提取，AFM1的回收率最高，提取效果最好。
　　 2因?yàn)楦衫一|(zhì)中成分較復(fù)雜，提取液中勢(shì)必帶有其它雜質(zhì)，為了得到更高的檢測(cè)精度，因此需要加入一個(gè)AFM1凈化提純的步驟，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)比采用親水親脂柱(OASISHLB)與AFM1免疫親和柱對(duì)AFM1的凈化提純效果，確定最佳的方法。試驗(yàn)結(jié)果表明，兩種方法對(duì)AFM1的凈化效果相當(dāng)，從降低檢測(cè)成本的角度考慮，采用價(jià)格更為便宜的親水親脂柱(OASISHLB)對(duì)AFM1進(jìn)行凈

8、化提純。并通過(guò)試驗(yàn)確定25％的乙腈-水溶液作為淋洗液，5ml的乙腈作為洗脫溶劑。
　　 3本方法在0.1～4ng/mL的濃度線性范圍內(nèi)對(duì)于干酪中AFM1的平均回收率為87.1％～92.2％,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.4％～5.7％，最低檢出限為0.037μg·kg-1。從檢測(cè)精度來(lái)看與現(xiàn)行國(guó)標(biāo)中第二法免疫親和層析凈化高效液相色譜法無(wú)顯著差異。本方法從樣品處理到最后完成AFM1的色譜分析，需要50～60min，對(duì)比現(xiàn)行國(guó)標(biāo)GB5