srap-pcr體系

1、組分Component用量（L）volume（L）10PCRbuffer2.5MgCl2(25mM)3.0dNTP(10mMeach)0.5rTaqDNAPolymerase(5UL)0.2Upstreamprimer(10M)0.5Downstreamprimer(10M)0.5DNATemplate(20ngL)2.0ddH2O15.8Finalvolume25.0反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，35℃退火

2、1min，72℃延伸1min，5個(gè)循環(huán)；94℃變性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。聚丙烯酰胺凝膠電泳分析聚丙烯酰胺凝膠電泳分析SRAP擴(kuò)增產(chǎn)物在6%非變性聚丙烯酰胺凝膠上分離，顯影步驟參照陳明亮等(2007)[207]的方法略有改動(dòng)。具體如下：電泳分析采用20cm20cm的豎直板電泳槽進(jìn)行。電泳液為1TBE。電泳參數(shù)：恒壓280V，約2.5h。SRAP擴(kuò)增產(chǎn)物上樣量4.0L，分子量

3、marker上樣量：1.0L。電泳完畢，剝膠，進(jìn)行銀染分析，具體操作如下：(1).將凝膠于250mL固定液（10％乙醇，0.5%冰乙酸）中固定15min；（固定液可重復(fù)利用數(shù)次，每次固定之前再加20mL左右5固定液）(2).在0.2%的硝酸銀滲透液中滲透30s；（銀染液可重復(fù)利用，新配的銀染液可重復(fù)利用，新配的可染時(shí)間短些，用過幾次后染色時(shí)間根據(jù)情況相應(yīng)延長(zhǎng)可染時(shí)間短些，用過幾次后染色時(shí)間根據(jù)情況相應(yīng)延長(zhǎng)）(3).蒸餾水漂洗30s；(4

4、).在顯色液（1.5%NaOH，0.4％甲醛）中顯色至條帶清晰；(5).自來水沖洗照相，以做分析。（用保鮮膜封起來，4℃可保存數(shù)月）2.2.2.7差異片段的聚丙烯酰胺凝膠回收與再擴(kuò)增差異片段的聚丙烯酰胺凝膠回收與再擴(kuò)增（1）特異片段的分離和二次擴(kuò)增用干凈的刀片將特異片段從聚丙烯酰胺凝膠上切下置于離心管中，滅菌雙蒸水洗3遍后，加100L10PCRbuffer于50℃下溫浴30min，20℃過夜。沸水浴20min，然后稍離心，上清轉(zhuǎn)入新離心

5、管，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，20℃沉淀30min。4℃，12000rmin離心20min，用75%乙醇洗沉淀，將沉淀風(fēng)干5~10min，最后溶于20L滅菌雙蒸水，用作模板，用與上述PCR相同的引物及體系再次進(jìn)行擴(kuò)增。為了增加回收產(chǎn)物的量，可將原反應(yīng)體系依比例擴(kuò)大二倍。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃2min；94℃30s，50℃30s，72℃60s，共35個(gè)循環(huán)；72℃10min。（2）目的片段的回收和純化將二次擴(kuò)增的產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠分離，在紫

6、外燈下切下目的片段，用純化試劑盒（上海生工UNIQ10柱式DNA膠回收試劑盒）純化。回收和純化的程序具體如下：A.切取含目的DNA片段的凝膠薄片，按400L100mg瓊脂糖凝膠的比例加入BindingBufferII，置于55C水浴約15min直至凝膠完全熔化，期間每?jī)煞昼娀靹蛞淮?；B.將融化的膠溶液轉(zhuǎn)移到套置在2mL收集管內(nèi)的UNIQ10柱中，室溫放置2分鐘，6000rmin室溫離心1min；（對(duì)于小于500bp的DNA片段，強(qiáng)烈強(qiáng)烈

7、建議將離心下來的液體重新加入原建議將離心下來的液體重新加入原UNIQ10柱中，柱中，6000rmin離心離心1min）C.取下UNIQ10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ10柱放入同一個(gè)收集管中，加入500LWashSolution，8000rmin室溫離心1min；D.重復(fù)步驟C一次；E.取下UNIQ10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ10柱放入同一個(gè)收集管中，12000rmin室溫離心2min；F.UNIQ10柱放入一根新的1.