直接PCR擴(kuò)增體系的建立與應(yīng)用性研究.pdf

1、生物恐怖的陰影籠罩全球，烈性傳染病也時有發(fā)生，對其進(jìn)行快速檢測和快速診斷能為采取相應(yīng)的處理措施和治療爭取時間，對社會意義重大。目前對生物戰(zhàn)劑的檢測和診斷，主要還依賴于后方實(shí)驗(yàn)室。在現(xiàn)場快速檢測和快速診斷方面，國內(nèi)尚未制式裝備配備軍隊，國外雖有開發(fā)，但還存在以下明顯問題：注重了檢測速度，但是特異性不強(qiáng)；要求了特異性，又因所能檢測的種類太少不能滿足需求；同時，檢測或診斷人員的安全性問題也一直沒有解決。成功開發(fā)能夠滿足高通量、高速度、高靈敏、

2、高特異、高安全檢測需求的現(xiàn)場快速檢測方法或裝備是解決以上問題的關(guān)鍵。 生物戰(zhàn)劑可分為病毒、細(xì)菌和毒素三類，因氣溶膠型生物戰(zhàn)劑易于加工、方便擴(kuò)散、施放隱匿，故生物戰(zhàn)劑多以氣溶膠形式施放(80％)。針對以氣溶膠形式施放的病毒和細(xì)菌等生物戰(zhàn)劑的現(xiàn)場快速檢測能夠解決生物戰(zhàn)劑現(xiàn)場快速檢測的主要問題。 針對生物戰(zhàn)劑的檢測，能滿足高速度、高靈敏、高特異需求的技術(shù)目前僅有核酸檢測和蛋白檢測兩種。核酸檢測針對的是特定生物戰(zhàn)劑的特異核酸片段

3、，現(xiàn)有的PCR檢測技術(shù)可以做到，僅需擁有生物戰(zhàn)劑的核酸序列信息；蛋白檢測針對的是特定生物戰(zhàn)劑的特殊蛋白，現(xiàn)有的免疫檢測技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)，但需要生物戰(zhàn)劑的蛋白方面的信息和相應(yīng)的單克隆抗體。當(dāng)前基因組研究發(fā)展迅速，而蛋白質(zhì)組研究相對滯后，單克隆抗體種類遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需求，因此對生物戰(zhàn)劑的快速檢測和快速診斷還只能選擇核酸檢測。 PCR檢測和診斷技術(shù)具有高速度、高靈敏、高特異的特點(diǎn)，如果能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測，尤其是現(xiàn)場自動化快速檢測，還能滿足高

4、通量的需求，同時也能解決檢測和診斷人員的安全性問題。但是，幾個“瓶頸”限制了PCR技術(shù)現(xiàn)場(自動化)快速檢測的應(yīng)用，這包括：標(biāo)本的預(yù)處理過程中的離心和影響反應(yīng)酶活性的變性劑的引入、高通量檢測過程中的微量加樣和自動化控制、反應(yīng)結(jié)果判讀所需的凝膠電泳步驟等。對這些“瓶頸”的疏通對解決生物戰(zhàn)劑的現(xiàn)場快速檢測問題具有重要意義。 標(biāo)本預(yù)處理的目的在于祛除樣本中蛋白、重金屬等對反應(yīng)的影響，以提高檢測的靈敏性和特異性。對PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑的相關(guān)

5、研究表明，某些PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑具有增強(qiáng)反應(yīng)的特異性、提高檢測的靈敏性、促進(jìn)對高GC含量序列的有效擴(kuò)增。這使我們有可能可以解決標(biāo)本預(yù)處理的問題，有望開發(fā)成為無須對樣本進(jìn)行核酸提純預(yù)處理的直接PCR擴(kuò)增體系。 一、研究目的建立及優(yōu)化一種簡便、快速、適合野外操作的核酸現(xiàn)場快速檢測技術(shù)，以克服PCR檢測技術(shù)現(xiàn)場應(yīng)用的主要“瓶頸”——復(fù)雜的樣本預(yù)處理；建立無須對樣本進(jìn)行核酸提純預(yù)處理的直接PCR擴(kuò)增體系；探討研發(fā)生物戰(zhàn)劑現(xiàn)場快速檢測裝置的

6、可行性。 二、材料方法1.選擇主要的PCR增強(qiáng)劑，采用分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常用的帶有pUC18質(zhì)粒的DH5α菌株，分別以經(jīng)過DNA提純的DNA或未經(jīng)DNA提純的菌液為模板，明確PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑對反應(yīng)的影響。 2.根據(jù)材料方法1的結(jié)果，建立了無須標(biāo)本預(yù)處理的直接PCR擴(kuò)增體系。 3.分別檢測該直接PCR擴(kuò)增體系對噬菌體(病毒)、帶有pUC18質(zhì)粒的DH5α菌株(細(xì)菌)等原核生物細(xì)胞及人A549細(xì)胞(真核生物細(xì)胞)中目的核

7、酸片段的擴(kuò)增效果；分別檢測該P(yáng)CR系統(tǒng)對三蒸水、生理鹽水、尿液、血液不同溶液稀釋的帶有pUC18質(zhì)粒的DH5α菌株核酸的擴(kuò)增效果及擴(kuò)增靈敏度水平；與國產(chǎn)的淋球菌PCR快速檢測試劑盒作對比，檢測該直接PCR擴(kuò)增體系的擴(kuò)增效果。 4.分別檢測進(jìn)一步簡化加樣操作步驟、省略加樣完畢進(jìn)行熱循環(huán)擴(kuò)增前的短暫離心步驟對該直接PCR擴(kuò)增體系擴(kuò)增效果的影響，檢驗(yàn)該直接PCR擴(kuò)增體系是否可應(yīng)用于直接多重PCR擴(kuò)增及能否省略結(jié)果凝膠電泳檢測步驟直接判

8、讀結(jié)果。 三、主要結(jié)果1.我們通過選擇、比較，采用不同種類的PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑，在未經(jīng)標(biāo)本預(yù)處理的條件下從菌液中擴(kuò)增出了目的核酸片段。這為我們建立簡便、快速、適合野外操作的直接PCR擴(kuò)增體系提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 2.在以上基礎(chǔ)上設(shè)計了直接PCR擴(kuò)增體系。 3.該直接PCR擴(kuò)增體系對噬菌體(病毒)、帶有pUC18質(zhì)粒的DH5α菌株(細(xì)菌)等原核生物細(xì)胞及真核生物細(xì)胞(人A549細(xì)胞)中的目的核酸片段都能有效擴(kuò)增。該直接P

9、CR擴(kuò)增體系對分別以三蒸水、生理鹽水、尿液、血液等不同溶液稀釋的帶有pUC18質(zhì)粒的DH5α菌株菌液中的目的核酸片段都能有效擴(kuò)增，其擴(kuò)增靈敏度依次為三蒸水＞生理鹽水＞尿液＞血液。與國產(chǎn)的淋球菌PCR快速檢測試劑盒作對比，該P(yáng)CR系統(tǒng)的擴(kuò)增效果良好，檢測靈敏度有一定提高。 4.該體系能夠用于直接多重PCR快速檢測，同時檢測多個目的核酸片段。對該直接PCR擴(kuò)增體系的加樣操作步驟進(jìn)行簡化，使檢測時只需再加適量模板，對檢測結(jié)果并6無明顯

10、不良影響。省略加樣完畢進(jìn)行熱循環(huán)擴(kuò)增前的短暫離心步驟對擴(kuò)增結(jié)果并無不良影響。非特異性熒光標(biāo)記技術(shù)因背景過高，并不適合應(yīng)用于該直接PCR擴(kuò)增體系的擴(kuò)增結(jié)果直接判讀。 四、討論：1.成功的設(shè)定直接PCR擴(kuò)增體系。直接PCR擴(kuò)增體系即無須對標(biāo)本進(jìn)行核酸取純，避免引入抑制PCRDNA多聚酶活性的變性劑及省略高速離心過程，能夠直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增的系統(tǒng)。采用該直接PCR擴(kuò)增體系，將無須進(jìn)行繁瑣的標(biāo)本DNA提純預(yù)處理，有效解決生物戰(zhàn)劑現(xiàn)場PC

11、R快速檢測“瓶頸”中的標(biāo)本預(yù)處理問題。 2.驗(yàn)證了所建立的直接PCR擴(kuò)增體系對噬菌體、細(xì)菌等原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中目的核酸片段的擴(kuò)增能力，證實(shí)了該直接PCR擴(kuò)增體系對原核細(xì)胞中目的核酸片段擴(kuò)增效果良好。驗(yàn)證了所建立的直接PCR擴(kuò)增體系對不同溶液稀釋的菌液標(biāo)本的擴(kuò)增能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明以三蒸水和生理鹽水為溶解體系，該直接PCR擴(kuò)增體系能保證高靈敏、高特異檢測。表明其能用來檢測生物戰(zhàn)劑，尤其適合氣溶膠型生物戰(zhàn)劑的現(xiàn)場檢測，三蒸水和生理鹽

12、水均可作為合適的生物戰(zhàn)劑采集裝置的洗滌液。 3.對比現(xiàn)有的國產(chǎn)淋球菌快速PCR檢測試劑盒，證實(shí)了該直接PCR擴(kuò)增體系具有至少相同的特異檢測靈敏度，而且還大大簡化了操作步驟，減少了人為污染造成的假陽性情形發(fā)生，使結(jié)果更為可信。 4.驗(yàn)證了所建立的直接PCR擴(kuò)增體系進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增的能力，并證實(shí)該系統(tǒng)能夠應(yīng)用于直接多重PCR擴(kuò)增。在對該直接PCR擴(kuò)增體系加樣操作進(jìn)一步簡化成功的基礎(chǔ)上，可據(jù)此開發(fā)便攜式生物戰(zhàn)劑現(xiàn)場快速檢測裝

13、置，適用于檢測不明生物戰(zhàn)劑。 5.在本研究的基礎(chǔ)上，采用該直接PCR擴(kuò)增體系，完全能夠開發(fā)基于直接多重PCR檢測技術(shù)的便攜式生物戰(zhàn)劑現(xiàn)場快速檢測裝置。 6.在本研究的基礎(chǔ)上，采用該直接PCR擴(kuò)增體系，結(jié)合現(xiàn)有的互聯(lián)網(wǎng)基因組信息(保證特異性)、標(biāo)本采集富集系統(tǒng)(保證高靈敏)、多重PCR技術(shù)(保證高通量)、實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)(保證結(jié)果直接判讀)、和目前國內(nèi)發(fā)展迅速的“中國芯”技術(shù)(自動化控制)，以我國現(xiàn)有的已經(jīng)比較強(qiáng)大的