同步檢測(cè)7種魚類病毒的擴(kuò)增子拯救多重PCR(Arm-PCR)方法的建立和初步應(yīng)用.pdf

1、淋巴囊腫病毒、腫大細(xì)胞病毒屬虹彩病毒、赤點(diǎn)石斑魚神經(jīng)壞死病毒、傳染性造血器官壞死病毒、傳染性胰臟壞死病毒、病毒性出血敗血癥病毒和傳染性鮭魚貧血癥病毒是養(yǎng)殖魚類主要的病毒性病原，危害巨大。為實(shí)現(xiàn)對(duì)這7種病原的高通量、同步檢測(cè)，本研究在分析了這些病毒基因序列的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了9組擴(kuò)增子拯救多重PCR（Arm-PCR）引物，并對(duì)擴(kuò)增體系中的Taq酶、Mg2+、dNTP、Primer Mix濃度及退火溫度等反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行調(diào)整和優(yōu)化，結(jié)合基因芯片檢測(cè)

2、技術(shù)，最終建立了一種能夠同步檢測(cè)7種魚類病毒的Arm-PCR方法。優(yōu)化后的Arm-PCR方法第一步PCR體系為：Taq酶（2.5 U/μL）1.0μL，10×PCR Buffer（含20 mmol/L的Mg2+）5μL，dNTP（各2.5 mmol/L）5μL，10×Primer Mix（各2μmol/L）9μL，模板1μL，ddH2O補(bǔ)足至50μL，退火溫度為56℃。
　　研究結(jié)果表明，該方法可以在1支反應(yīng)管內(nèi)對(duì)上述7種病毒的9

3、個(gè)致病基因同步進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)，其檢測(cè)靈敏度分別為101 copies/μL（RGNNV、VHSV、ISAV-NS、ISAV-MA）、102 copies/μL（LCDV、Mega、IHNV、IPNV）和103 copies/μL（TRBIV）。該方法特異性強(qiáng)，與半滑舌鰨、石斑魚、大菱鲆和牙鲆基因組DNA不產(chǎn)生交叉反應(yīng)。本研究建立的可同步檢測(cè)7種魚類病毒的Arm-PCR方法具有高通量、高靈敏度、高準(zhǔn)確性的優(yōu)勢(shì)，能有效地提高工作效率，在魚類