pcr臨床應(yīng)用_第1頁
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文檔簡介

1、熒光定量PCR技術(shù)在臨床檢測中的應(yīng)用,黃少軍 市中心醫(yī)院,PCR與基因診斷技術(shù),基因診斷即通過核酸的分子生物學(xué)檢測直接檢測基因的存在狀態(tài)或缺陷對疾病作出診斷的方法。Polymerase chain reaction(PCR),聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),是一種DNA的快速擴(kuò)增技術(shù)。PCR技術(shù)通過兩個(gè)短的稱為引物的DNA小片段和一種耐熱酶的作用,可在3個(gè)小時(shí)內(nèi)把特定的DNA片段擴(kuò)增1000萬倍。 九十年代中期PCR臨床應(yīng)用在國內(nèi)全面開展,1

2、998年,熒光定量PCR技術(shù)開始在中國應(yīng)用于臨床檢測。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,4 基因診斷,3 免疫學(xué)診斷,臨床診斷,細(xì)胞膜,細(xì)胞核,DNA,轉(zhuǎn)錄,mRNA,翻譯,蛋白質(zhì),1 形態(tài)學(xué)診斷,2 生化診斷,,概念,基本原理,以DNA為例(1)DNA變性:(2)降溫退火:(3)引物延伸:,原理 第一步 – 加熱變性,預(yù)處理,第二步 – 引物與靶序列退火,,第三步 - 引物延伸,第1個(gè) PCR 循環(huán)完

3、成后 – 得到兩個(gè)拷貝的靶序列,PCRPCR.exe動(dòng)畫,30次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量,No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,824,熒光PCR的原理,PCR技術(shù)的特點(diǎn),靈敏度高 特異性強(qiáng) 快速簡便 應(yīng)用范圍廣,Ct值的意義,Ct值與重復(fù)性同一樣本在相同條件下同

4、時(shí)進(jìn)行96次擴(kuò)增,FQ-PCR,Ct值與濃度不同的模板達(dá)到熒光域值時(shí)的Ct值不同,,感染性疾病的診斷 母嬰傳播的控制與觀察 遺傳疾病的診斷 腫瘤的診斷 法醫(yī)學(xué)鑒定,熒光定量PCR的臨床應(yīng)用,早期診斷 病情評估和預(yù)后判斷 抗病毒藥物療效的觀察、指導(dǎo) 新藥驗(yàn)證,一 感染性疾病  1. 病原體含量與病情之間的關(guān)系  2. 病原體含量與用藥之間的關(guān)系  3. 藥物及療法的研究與開發(fā)  4. 新的病原體分子診斷

5、標(biāo)準(zhǔn)  5. 新的愈后指標(biāo)  6. 傳染病發(fā)病的監(jiān)控、預(yù)測與預(yù)防,臨床應(yīng)用,臨床應(yīng)用,,二 腫瘤1. 腫瘤標(biāo)志物:癌胚抗原、同功酶、抗體、激素、細(xì)胞因子、受體等2. 腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的檢測:包括癌基因抗癌基因、腫瘤轉(zhuǎn)移基因及轉(zhuǎn)移抑制基因,三 遺傳病1. 等位基因檢測2. 多基因遺傳病的突變檢測3. 基因表達(dá)異常所致遺傳病檢測,1.親子鑒定 2.法醫(yī)物證 3.PCR-RFLP技術(shù)的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用

6、4.罪犯鑒定,法醫(yī)鑒定,免疫學(xué)診斷主要是抗原抗體反應(yīng),應(yīng)用于臨床通常在體內(nèi)產(chǎn)生抗體以后,而許多病原體的免疫學(xué)檢測存在較長的“窗口期”,不利于對疾病的早期診斷;PCR方法直接檢測病原體的DNA/RNA,能大大縮短“窗口期”,其高靈敏度的檢測顯然也有利于疾病的早期診斷。,疾病的早期診斷,熒光定量PCR在病原體檢測中的應(yīng)用,一 肝炎病毒定量檢測二 性病病原體檢測三 結(jié)核桿菌及呼吸道病原體檢測四 優(yōu)生優(yōu)育(TORCH)相關(guān)項(xiàng)目

7、檢測,臨床應(yīng)用,肝炎病毒定量檢測HBVHCV,臨床應(yīng)用,(一) 乙型肝炎病毒結(jié)構(gòu)及特點(diǎn),HBsAg:是HBV感染的主要標(biāo)志HBsAb:保護(hù)性抗體HBcAg:僅存于感染的肝細(xì)胞核內(nèi),    一般不存在于血循環(huán)中HBcAb: 非保護(hù)性抗體,HBcAb-IgM    提示HBV處于復(fù)制狀態(tài)HBeAg:HBV復(fù)制及強(qiáng)感染性的指標(biāo)HBeAb:有一定的保護(hù)作用,預(yù)后良好,HBV,HBV,(二) HBV-DNA與“兩對半”

8、,1. “兩對半” :機(jī)體的免疫反應(yīng)狀態(tài);,2. “攜帶者”、“大三陽”、“小三陽”等免疫學(xué)指標(biāo)不能 反應(yīng)體內(nèi)病毒復(fù)制水平與感染程度。,FQ-PCR:檢測的是HBV本身的遺傳物質(zhì)—DNA,是 病毒存在和復(fù)制的最可靠、最直接的指標(biāo)。,3. 血清學(xué)指標(biāo)(-)不能排除HBV感染。,HBV,(二) HBV-DNA與“兩對半”,,4. 也可能出現(xiàn)HBsAg(+),HBV-DNA(-)。,5.

9、 HBsAb (+) 、 HBcAb (+) 、 HBeAb (+)三抗體陽性 與HBV DNA 2.5× 103 copy /ml 結(jié)果解釋。,HBV,(三) HBV-DNA定量檢測的臨床意義,3. HBV-DNA定量與預(yù)后    a. 含量高者急性肝炎患者易慢性化     b. 癌變的幾率明顯高于含量低者,1. HBV-DNA定量與HBV復(fù)制水平及傳染性,2. HBV-DNA定量與乙肝藥物療效

10、   a. 專家提出<103 copy /ml做為陰性或臨床治愈標(biāo)準(zhǔn) b. HBV-DNA定量分析與干擾素治療(前、中、后) c. 拉咪呋啶,HBV,(三) HBV-DNA定量檢測的臨床意義,4. HBV-DNA定量有助于指導(dǎo)懷孕與孕期,哺乳期檢查,6. 血液制品和獻(xiàn)血員的篩選,HBV DNA檢測的臨床意義,HBV DNA是HBV存在最直接的依據(jù)HBV DNA是HBV

11、復(fù)制的標(biāo)志HBV DNA是患者具有傳染性的標(biāo)志HBV DNA對乙肝兩對半起補(bǔ)充作用HBV DNA是目前判斷乙肝抗病毒藥物療效最敏感的指標(biāo)HBV DNA可檢測出隱匿性慢性乙型肝炎,病毒特點(diǎn): 1. 單正鏈RNA病毒 2. E1和E2區(qū)基因高度變異性,(一)丙型肝炎病毒特點(diǎn),HCV,感染特點(diǎn):HCV在血中含量極微 輸血后肝炎主要致病因子免疫學(xué)標(biāo)志僅有抗-HCV,非中和抗體,產(chǎn)生時(shí)間不一有一部分人感染H

12、CV后,不產(chǎn)生抗-HCV 感染易于慢性化(50-85%)疫苗研制尚不成功,單鏈RNA,,(二) HCV-RNA定量檢測的臨床意義,1. 早期診斷 a. 臨床以< 80 copy/ml做為無感染或治愈標(biāo)準(zhǔn)。 b. HCV感染1-3W,即可檢出HCV-RNA的存在。 c. 嚴(yán)格篩選獻(xiàn)血員 ,提高對窗口期感染者的檢出率。,HCV,HCV,(二) HCV-RNA定量檢測的臨床意義,2. HCV-RNA

13、載量與抗-HCV滴度、ALT水平之間的相關(guān)性。   抗-HCV滴度和ALT異常率隨著HCV-RNA載量升高而增加。,3. HCV-RNA是評價(jià)抗病毒治療效果的重要指標(biāo)。,4. 慢性丙型肝炎長期抗-HCV陽性,這時(shí)如果進(jìn)行HCV-RNA 定量檢測可以鑒別活動(dòng)性、復(fù)制程度。,二 常見性傳播疾病病原體,一 淋球菌(NGH)二 沙眼衣原體( CT )三 解脲脲原體(UU)四 梅毒螺旋體(TP)五 單純庖疹病毒(HSV

14、)六 乳頭瘤病毒(HPV)七 人類免疫缺陷病毒(HIV),STD,NGH,淋球菌感染與致病,1. 人是淋球菌的惟一宿主。,2. 發(fā)病率最高,在所STD疾病中,高達(dá)60%左右。,3. 發(fā)病趨勢: a. 男性多于女性。 b. 城市走向農(nóng)村, c. 高收入階層向低收入階層擴(kuò)展,4. 人對淋球菌感染無天然抵抗力

15、,免疫不持 久,再感染和慢性患者普遍存在。,5. 如母親為淋病患者,嬰兒出生時(shí)易患上淋球菌性結(jié)膜炎,CT,沙眼衣原體感染與致病,1. 嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生。,2. 不僅可致眼部感染、肺部感染、也是STD的主要 病原體。,3. 近年來在歐美等國,沙眼衣原體的感染率和危害 性已超過淋球菌而居STD之首。,4. 在我國,在非淋球菌性尿道炎中,居首位。,5. 泌尿生殖道感染,妨礙妊娠。,6. 盆腔感染,可致生殖能力損害。,UU

16、,解脲脲原體感染與致病,合成尿素酶,分解尿素,2. 在非淋球菌性尿道炎其感染率僅次于衣原 體感染,居第二位。,3. 流產(chǎn)超過4次以上者,檢出率高達(dá)80%。,4. 有30-40%男性尿道炎是由感染UU所致。,5. 與男性不育相關(guān)。男性不育患者精液中,脲原體檢出率高達(dá)66.6%。檢出率隨精子數(shù)減少和精子活動(dòng)力下降而升高。,1. 非培養(yǎng)或形態(tài)學(xué)檢查的診斷技術(shù),快速、特異、敏感。2. 對無癥狀或癥狀輕者,可以早期確診。3. 對NG

17、H、CT、UU 等混合感染者,診斷和鑒別診斷。4. 指導(dǎo)用藥、考核療效。,熒光定量PCR診斷NGH/CT/UU的意義,NGH/CT/UU,NGH/CT/UU,熒光定量PCR診斷NGH/CT/UU的意義,5. 不孕不育、優(yōu)生優(yōu)育。6. 流行病學(xué)調(diào)查,為性傳播疾病的監(jiān)控提供依據(jù)。,,CT、UU、NGH、 HPV、 TP除NGH可培養(yǎng)外,其余難培養(yǎng)或者不能培養(yǎng)。即使能培養(yǎng),所需時(shí)間長—48小時(shí)↑。,人乳頭瘤病毒感染與致病,1. HP

18、V具有宿主和組織特異性,只能感染人的皮膚和黏膜上皮細(xì)胞,人是HPV的惟一宿主。2. 有100多個(gè)型。3. 低危型:HPV 6、11引起良性病變 (尖銳濕疣、喉乳頭瘤等),HPV,人乳頭瘤病毒感染與致病,HPV,4. 高危型:HPV 16、18引起惡性腫瘤 (宮頸癌、 肛門癌、口腔癌等)5. 免疫原性低,易形成持續(xù)性感染。6. 新生兒產(chǎn)道感染。,看看這些英年早逝的藝人,她們死于宮頸癌……宮頸癌的知曉率在

19、不斷提高。,梅艷芳(40歲),國家一級演員李媛媛(41歲),HPV,1. 對典型病例可以明確診斷。2. 對臨床表現(xiàn)和組織病理改變都不典型的病例同樣可以做出診斷。3. 對亞臨床和隱性HPV感染做出診斷。4. 基因分型。5. 考核療效與預(yù)后。6. 病毒載量與患癌癥風(fēng)險(xiǎn)。,HPV,,熒光定量PCR檢測HPV的意義,HPV,三 結(jié)核桿菌與呼吸道病原體檢測,TB:Tubercle bacilliCP:Chlamydia pn

20、eumoniaMP:Mycoplasmal pneumoniaSARS:severe acute respiratory syndrome,結(jié)核桿菌流行現(xiàn)狀(1),羅伯特·科赫(1843——1910),德國細(xì)菌學(xué)家,結(jié)核桿菌發(fā)現(xiàn)者 結(jié)核病是一個(gè)全球性的問題,近年來在世界范圍內(nèi)出現(xiàn)流行,且呈增長的趨勢,TB,結(jié)核桿菌流行現(xiàn)狀(2),我國結(jié)核病的疫情僅次于印度而居世界第二位 2000年,全國人口結(jié)核感染率為44.5%,其中

21、15~44歲人群占了53% ,每年約有25萬人死于結(jié)核病,結(jié)核桿菌引起的感染,肺部感染:原發(fā)性肺結(jié)核,開放性肺結(jié)核。肺外感染:腦、腎、骨、關(guān)節(jié)、生殖結(jié)核、腸結(jié)核、結(jié)核性腹膜炎、全身性結(jié)核。,常規(guī)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷方法及不足,1. 痰涂片作抗酸染色:陽性率低 、費(fèi)時(shí)2. 細(xì)胞培養(yǎng)“金標(biāo)準(zhǔn)”:周期太長(3-4W)3. 血清學(xué)診斷: a. 接種BCG可出現(xiàn)陽性 b. 不能區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病和治愈后留下?lián)p

22、傷灶的病人 c. 交叉反應(yīng),假陽性不能早期診斷!容易漏診、誤診!,TB,熒光定量PCR檢測TB-DNA的意義,1. 能穩(wěn)定檢測10copy的TB-DNA ,靈敏度高 ,特異性強(qiáng)2. 早期、快速、準(zhǔn)確地診斷結(jié)核病。 痰液、肺及支氣管灌洗液——肺結(jié)核 血液——播散性結(jié)核和各臟器的結(jié)核病   腦脊液——中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病 宮頸拭子、尿道拭子—

23、—泌尿生殖道結(jié)核病,TB,3. 熒光定量PCR檢出結(jié)核桿菌陽性率顯著高于痰涂片抗酸染色和改良羅氏培養(yǎng)法。 4. TB-DNA濃度可用于判斷療效: 痰標(biāo)本中結(jié)核桿菌的數(shù)量呈逐漸下降趨勢 ,TB-DNA拷貝數(shù)下降。根據(jù)病原體DNA濃度,對藥物治療及療效觀察提供參考依據(jù),TB,熒光定量PCR檢測TB-DNA的意義,四 TORCH感染特點(diǎn)與檢測,TOX : Toxoplasma  gondiiR

24、V: Rubella virus CMV: Human cytomegalovirusHSV: Herpes simplex virus,TORCH,TORCH感染特點(diǎn),1. 母-胎傳播的主要病原體    2. 引起胎兒畸形新生兒缺陷的重要原因   3. 自然狀態(tài)下呈隱性感染   4. 懷孕、多次輸血、AIDS等易發(fā)生顯性感染 5. 可致多發(fā)性、全身性感染   6.

25、只有風(fēng)疹可獲得長久的免疫力,可用疫苗預(yù)防,TORCH,(一) 弓形蟲感染與致病,滋養(yǎng)體如弓形 ,廣泛分布,人獸共患。寄生在有核細(xì)胞中,貓和貓科動(dòng)物是終宿主易感者多,免疫者少 我國智力低下兒的弓形蟲感染率28% 畸形兒的弓形蟲抗體IgM陽性率12.25% 艾滋病患者約有20%~80%合并弓形蟲感染 ,造成艾滋病死亡的一個(gè)重要并發(fā)病,TORCH –TOX,人群自然感染率達(dá)到60-90%,多為隱性感染免疫功能低下(懷孕

26、、多次輸血、器官移植、AIDS)發(fā)生顯性感染可發(fā)生垂直傳播,是宮內(nèi)感染和胎兒畸形的主要病毒之一圍生期感染血、尿、乳汁、精液、分泌物中都可檢出病毒,(二) 人巨細(xì)胞病毒感染與致病,TORCH-CMV,風(fēng)疹是一種世界性的病毒傳染病, 是造成畸胎及先天性疾病的病毒之一 出疹前1周至出疹后5天均有傳染性人是風(fēng)疹病毒的唯一宿主 風(fēng)疹感染后可獲得持久的免疫力,臨床顯性再感染并不多見。,(三) 人風(fēng)疹病毒感染與致病,TORCH-RV,

27、先天性風(fēng)疹感染往往發(fā)生在母體初次感染之時(shí),可致先天性風(fēng)疹綜合癥(CRS) 三聯(lián)癥:白內(nèi)障、耳聾、心臟病。 妊娠時(shí)體內(nèi)皮質(zhì)類固醇激素的增加以及細(xì)胞免疫功能的減弱,這種對正常人無害的再感染有可能造成病毒蔓延以至影響胎兒。,TORCH-RV,(三) 人風(fēng)疹病毒感染與致病,HSV原發(fā)感染多為隱性,大多無臨床癥狀或呈亞臨床表現(xiàn) HSV-1主要引起口唇皰疹,皰疹性結(jié)膜炎、腦炎,皮膚性皰疹HSV-2主要引起原發(fā)性生殖器皰疹 (80%) 。H

28、SV感染后大多數(shù)個(gè)體不能徹底消滅病毒,也不能阻止復(fù)發(fā),病毒以潛伏狀態(tài)長期存在宿主體內(nèi)。,TORCH-HSV,(四) 人單純皰疹病毒感染與致病,妊娠期婦女因HSV-1被激活,可通過胎盤感染胎兒,引起胎兒畸形、智力低下、流產(chǎn)等。圍產(chǎn)期感染可引發(fā)新生兒皰疹,死亡率高達(dá)50%以上。 HSV常與HIV-1同時(shí)感染,并能促進(jìn)病情發(fā)展,引起嚴(yán)重的局部和播散性感染。目前認(rèn)為HSV是一種調(diào)節(jié)因素,能激活HIV復(fù)制 與宮頸癌關(guān)系密切。,TORCH-

29、HSV,(四) 人單純皰疹病毒感染與致病,常規(guī)TORCH檢測方法與不足,組織培養(yǎng)或病原體分離:慢,費(fèi)力,陽性率低。血清學(xué)診斷:    IgG: 人群自然感染率高達(dá)60-90%。 IgG(+)不能區(qū)別既住感染與現(xiàn)癥感染;     新生兒IgG(+)不能說明有感染?! ?IgM: IgM(+)可能是原發(fā)性感染;      IgM(-)不能排除感染。,TORCH,局限性: 1. 不能定量分析

30、     2. 抗體的產(chǎn)生受多種因素的影響     3. 交叉反應(yīng),假陽性,熒光探針檢測TORCH的優(yōu)勢,原理:直接檢測TORCH病原體的核酸優(yōu)點(diǎn):靈敏、快速,特異 意義:早期診斷,婦幼保健、優(yōu)生優(yōu)育   1. 篩選TORCH患者,提高出生人口素質(zhì)?!   ?. 有利于預(yù)測胎兒宮內(nèi)感染狀況及妊娠結(jié)局。    3. TORCH感染孕婦的治療效果觀察?!  ?. 器官移植、免疫系統(tǒng)疾病等病人監(jiān)控。

31、 5. 建立TORCH的分子診斷標(biāo)準(zhǔn),TORCH,TORCH,,TORCH檢測核酸與檢測標(biāo)本的比較,檢驗(yàn)結(jié)果解析,HBV--DNA定量結(jié)果定量測定,測定的是病毒量的“多”或“少”;結(jié)果報(bào)告方式:>多少?,<多少?具體值?,舉例,例如:試劑盒檢測范圍是103—108IU/ml,我們測定的陰性結(jié)果應(yīng)報(bào)告< 103 IU/ml;(無、含量低)。中間值報(bào)告具體數(shù)據(jù);當(dāng)含量高于最高檢測限時(shí),報(bào)告>108 IU/ml。( 108

32、 IU/ml; 109 IU/ml …..) 參考范圍?,,IU/ml與COP/mlD的換算---咨詢廠家 3.5E+05 IU/ml----表示一毫升血清中有350,000個(gè)HBV病毒微粒。,HBV—DNA的變化,在患者治療過程中檢測HBV—DNA定量,一般認(rèn)為:其結(jié)果相差5倍屬正常波動(dòng),結(jié)果相差降低10倍以上才算治療有效。,例如1,有一患者治療前檢測HBV-DNA定量為8.8E+06 IU/ml,治療一月后復(fù)查為2.3

33、E+07 IU/ml,兩結(jié)果相差2.6倍。(不一定是高了?)如何向病人解釋:屬正常波動(dòng)或者檢測誤差(允許誤差),例如2,一患者治療前檢測HBV-DNA定量為9.2E+06 IU/ml;治療一月后復(fù)查為2.8E+06 IU/ml,兩結(jié)果相差3.3倍,不能說明治療有效,需要繼續(xù)觀察。要有明顯的下降趨勢。,檢驗(yàn)報(bào)告單結(jié)果讀取,3.637E+06 檢測下限: 1000拷貝/毫升3.637×106

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