瓠瓜EST-SSR、SRAP、ISSR和RAPD反應體系的建立及其純度鑒定應用的研究.pdf

1、瓠瓜(LagenariavulgarisSer.)是一種重要的蔬菜，營養(yǎng)豐富，有較好的保健功能。對瓠瓜雜種鑒定的研究，有利于種子市場的管理、瓠瓜種質收集與保存，對保護新品種的知識產權和育種家們的權益具有重要意義。本研究采用EST-SSR、SRAP、ISSR和RAPD4種分子標記技術，在優(yōu)化反應體系的基礎上，建立瓠瓜雜種純度室內快速鑒定技術體系。主要研究結果如下： 1.在前人研究的基礎上，借鑒其他葫蘆科作物的研究成果，利用正交試驗

2、設計和單因素試驗相結合的方法優(yōu)化EST-SSR、SRAP、ISSR和RAPD反應體系及擴增程序，摸索出一套適合于瓠瓜雜種鑒定的EST-SSR、SRAP、ISSR和RAPD反應體系。 各分子標記的最佳反應體系及程序如下： (1)優(yōu)化后的EST-SSR反應體系：10μl反應體系中，TaqDNA聚合酶、引物、dNTPs、Mg2+4種主要成分的最適濃度分別為：0.5U、0.1μmol/L、100μmol/L和0.75mmol/L

3、。 (2)優(yōu)化的SRAP反應體系(20μl)，TaqDNA聚合酶、模板、引物、dNTPs、Mg2+5種主要成分的最適濃度分別為：1.25U、30ng、0.5μmol/L、100μmol/L、2mmol/L。在8％的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳下檢測結果，穩(wěn)壓120V。 (3)優(yōu)化后的ISSR反應體系：在20μl的反應體系中，TaqDNA聚合酶、模板、引物、dNTPs、Mg2+5種主要成分的最適濃度分別為：0.5U、40ng、

4、0.75μmol/L、150μmol/L、2mmol/L。最佳擴增程序為：94℃預變性5min；92℃變性30s：58℃退火45s；72℃延伸1.5min；循環(huán)35次：最后72℃延伸7min：4℃保存，在1.8％的瓊脂糖凝膠電泳上檢測擴增結果。 (4)優(yōu)化后的RAPD反應體系：在20μl的反應體系中，TaqDNA聚合酶、模板、引物、dNTPs、Mg2+5種主要成分的最適濃度分別為：1U、30ng、1.5ng/μl、150μmol

5、/L和1.75mmol/L。 2.56對甜瓜屬、54對黃瓜屬和10對苦瓜屬EST-SSR引物對3個雜交種及親本沒有擴增出多態(tài)性；市場上購買的9個瓠瓜品種及本實驗室培育的3個雜交種(06-2×06-6、06-4×06-5、06-1×06-5)之間有兩對引物擴增出多態(tài)性，可以區(qū)分3個品種。 3.本實驗從12對引物組合中沒有篩選出可以鑒別3個雜交種及親本的有效引物對，但12對SRAP引物組合中有4對引物組合(em2/me6、e

6、m3/me1、em3/me2、em5/me2)在本實驗室的3個雜交種(06-2×06-6、06-4×06-5、06-1×06-5)和購買的9個瓠瓜品種之間擴增出多態(tài)性，共擴增出46條帶，20條多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率達43.48％。4對引物組合可將市場購買的9個瓠瓜品種完全區(qū)分開，并且除2號品種外的其他8個品種可以與本實驗室的3個雜交種區(qū)分開。 4.24條ISSR引物，在3個雜交組合及親本和購買的9個瓠瓜品種之間沒有擴增出多態(tài)性。

7、 5.本實驗從186條RAPD隨機引物中篩選出9條引物用于3個瓠瓜雜交種的純度鑒定。其中組合06-2×06-6，獲得2條偏母型引物和2條缺失型引物；組合06-1×06-5，獲得3條偏父型引物和2條缺失型引物；組合06-4×06-5，獲得4條偏母型和1條偏父型引物。 6.綜合4種標記的分析結果，RAPD和SRAP標記更適合瓠瓜的雜種鑒定。所以可以將RAPD和SRAP兩種標記結合使用，利用SRAP技術的分辨率高、穩(wěn)定性強和R