利用ISSR和EST-SSR標(biāo)記研究中國茶樹資源的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu).pdf

1、茶樹(Camellia sinensis(L.) O. Kuntze)屬于山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia）茶組(Sect.Thea(L.) Dyer)植物，原產(chǎn)于中國，是世界上最重要的飲料作物之一。在復(fù)雜多樣的生態(tài)條件下，經(jīng)過長期的自然演化和人工選擇，形成了豐富多樣的茶樹種質(zhì)資源，這其中蘊(yùn)含著高抗、優(yōu)質(zhì)等重要優(yōu)異性狀的基因資源。充分了解和掌握茶樹種質(zhì)資源的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，是開展茶樹種質(zhì)資源收集保存、有益基因發(fā)掘

2、和品種選育的重要基礎(chǔ)。由于DNA標(biāo)記具有多態(tài)性高、鑒定準(zhǔn)確快速等優(yōu)點(diǎn)，故它已成為茶樹遺傳多樣性研究的重要技術(shù)和手段。本研究利用微衛(wèi)星相關(guān)標(biāo)記ISSR或EST-SSR技術(shù)，分析了中國不同類型、不同地區(qū)茶樹資源的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，并基于EST-SSR標(biāo)記的基因分型，分析了茶樹分子標(biāo)記與表型性狀的關(guān)聯(lián)性。
　　 1、ISSR和EST-SSR標(biāo)記在茶樹遺傳多樣性研究上的比較分析
　　 比較了ISSR和EST-SSR在多態(tài)性位

3、點(diǎn)數(shù)、引物解析能力、多態(tài)性信息含量和標(biāo)記系數(shù)等方面的差異，結(jié)果表明在位點(diǎn)檢測能力上ISSR明顯高于SSR，每條ISSR引物可檢測的平均條帶數(shù)(12.5)比每對EST-SSR引物(3.1)高3倍。ISSR標(biāo)記的Rp值是EST-SSR標(biāo)記的6.3倍，表現(xiàn)出較高的品種鑒別方面能力。ISSR標(biāo)記多態(tài)性信息含量(PIC)和標(biāo)記系數(shù)( MI)也明顯高于EST-SSR，說明ISSR具較高的位點(diǎn)多態(tài)性和較高的標(biāo)記效率。
　　 盡管兩種標(biāo)記在檢測

4、中國、日本和肯尼亞茶樹資源的遺傳多樣性差異上表現(xiàn)出較一致的趨勢，但基于ISSR估算的遺傳多樣性指數(shù)(H=0.21)低于EST-SSR( H=0.28)，這可能是由于ISSR屬顯性標(biāo)記，無法檢測到等位位點(diǎn)的變異，遺漏了部分重要的遺傳信息，導(dǎo)致對遺傳多樣性水平的估計(jì)出現(xiàn)偏差，進(jìn)而影響到遺傳距離的估算和聚類分析的結(jié)果。而EST-SSR可以檢測到等位位點(diǎn)的變異，比ISSR能更準(zhǔn)確地反映和揭示供試品種的遺傳多樣性水平。同時(shí)由于單個(gè)EST-SSR標(biāo)

5、記檢測到的位點(diǎn)數(shù)量較ISSR標(biāo)記少，且特異性較強(qiáng)，譜帶較易分辨，因此EST-SSR比ISSR標(biāo)記更適用于對大量樣本的分析。
　　 2、中國無性系育成品種的遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析
　　 利用27個(gè)ISSR引物對36個(gè)無性系茶樹育成品種的DNA進(jìn)行了擴(kuò)增，共獲得了500條多態(tài)性條帶，平均每個(gè)引物擴(kuò)增的多態(tài)性條帶為18.5條。ISSR引物的Rp值較高，平均為9.59（變異范圍5.69-14.47），表明具備較強(qiáng)的品種鑒別能力

6、。IR29和IR44單個(gè)引物擴(kuò)增形成的DNA指紋即可辨別36個(gè)不同的茶樹品種。遺傳多樣性分析表明，不同地區(qū)育成品種的遺傳多樣性水平略有差異，遺傳多樣性指數(shù)(H)和Shannon信息指數(shù)(I)的變異范圍分別是0.20-0.23和0.31-0.36。區(qū)域間茶樹品種的遺傳分化指數(shù)(Gst)的平均值為0.18，表明僅有18％的遺傳多樣性來源于區(qū)域間的差異，而82％的遺傳多樣性源自于區(qū)域內(nèi)品種間的遺傳差異。10個(gè)大面積主栽茶樹品種的遺傳多樣性占供

7、試品種總體多樣性水平的88％?；贗SSR和EST-SSR標(biāo)記的比較分析均表明，中國主栽茶樹品種的遺傳多樣性明顯高于日本和肯尼亞的茶樹品種，表現(xiàn)出較廣泛的遺傳基礎(chǔ)。聚類分析表明，茶樹育成品種的親緣關(guān)系不僅與其遺傳背景有關(guān)，而且與地理來源有關(guān)。
　　 3、中國綠茶與烏龍茶適制品種遺傳多樣性差異的比較分析
　　 基于EST-SSR標(biāo)記研究了31份綠茶和37份烏龍茶適制品種資源的遺傳多樣性差異，結(jié)果表明烏龍茶品種基因多樣性指數(shù)

8、(H)、多態(tài)性信息含量(PIC)和平均遺傳距離(GD)均略高于綠茶品種。基于數(shù)學(xué)模型的聚類分析將供試品種分為兩個(gè)亞類群，亞群A中67.9％的品種為烏龍茶適制品種；亞群B中71.0％的綠茶品種聚類其中?；贜ei遺傳距離的聚類分析將供試品種分為三個(gè)類群，其中類群I和II中以烏龍茶品種為主，分別占69.6％和66.7％；而類群III中包括了61.3％的綠茶品種。兩種聚類方法均表明，大部分樣本按品種適制類型聚類，但也有部分品種在群體結(jié)構(gòu)中相互

9、滲透，呈較明顯的穿插分布，推測這與品種的地理來源和遺傳背景有關(guān)。
　　 4、中國茶樹初選核心種質(zhì)的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析
　　 基于EST-SSR標(biāo)記對272份初選茶樹核心種質(zhì)的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明供試種質(zhì)的平均多態(tài)性信息含量( PIC)值為0.531，平均基因多樣性(H)為0.562。依據(jù)PIC和H值的大小，對不同省區(qū)茶樹資源的遺傳多樣性按由高到低的水平排序，依次為：廣西>云南>廣東>福建>浙江>

10、湖北>江西>重慶>貴州>陜西>四川>安徽>湖南。我國茶樹資源的遺傳多樣性的空間分布呈現(xiàn)的特點(diǎn)是，遺傳多樣性從茶樹原產(chǎn)地由南向北，由西向東遞減，并且沿海地區(qū)高于內(nèi)陸地區(qū)，這為研究我國茶樹遺傳演化的地理路徑提供了參考依據(jù)。
　　 對不同種質(zhì)類型茶樹的遺傳多樣性進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)野生茶樹群體的遺傳多樣性( H=0.563，PIC=0.529)高于地方品種(H=0.550，PIC=0.520)和選育品種(H=0.556，PIC=0.52

11、3)，說明在栽培馴化和人工選擇壓力下，導(dǎo)致部分等位位點(diǎn)丟失.使栽培茶樹的遺傳多樣性水平略有下降。對EST-SSR位點(diǎn)間的連鎖不平衡(LD)情況進(jìn)行配對檢測，結(jié)果表明地方品種和選育品種（系）的不平衡成對位點(diǎn)數(shù)高于野生茶樹資源，推測栽培茶樹中較頻繁的異交以及對特定基因位點(diǎn)的人為選擇使位點(diǎn)間的連鎖不平衡程度增加。
　　 AMOVA分析表明，茶樹的遺傳多樣性主要源于茶樹群體內(nèi)的遺傳差異，群體間的遺傳差異對整體遺傳多樣性的貢獻(xiàn)較少(0.7

12、％.1.2％)，這主要是由于茶樹作為異花授粉植物，其強(qiáng)大的基因流促進(jìn)了不同群體間的基因交換，導(dǎo)致群體間的基因和基因型頻率逐漸接近，分化系數(shù)降低，遺傳距離較近?；跀?shù)學(xué)模型聚類將供試種質(zhì)分為5個(gè)亞類群，而基于Nei遺傳距離的聚類分析將供試種質(zhì)分為4個(gè)群，其中亞群內(nèi)的聚類品種基本與數(shù)學(xué)模型聚類的結(jié)果基本對應(yīng)。兩種聚類分析均表明，中國茶樹資源存在明顯的遺傳結(jié)構(gòu)，它與地理來源和種質(zhì)類型均存在相關(guān)性。盡管多數(shù)地理來源相同的種質(zhì)往往共聚在小類群中，

13、但也有部分地理來源相同的種質(zhì)分別在不同群中分散聚類的情況，說明中國初選茶樹核心種質(zhì)具有遺傳多樣性分布廣泛的特點(diǎn)。
　　 5、基于基因分型初步鑒定與茶樹表型性狀關(guān)聯(lián)的EST-SSR標(biāo)記
　　 通過EST-SSR標(biāo)記對112份材料進(jìn)行基因分型，開展了分子標(biāo)記與新梢一芽二葉長( BI)、一芽二葉百芽重(BW)、葉片長度(II)、葉片寬度(LW)、咖啡堿含量(CAF)、氨基酸含量( AA)和茶多酚含量(TP)共7個(gè)茶樹表型性狀關(guān)

14、聯(lián)的初步分析。結(jié)果表明，在不考慮位點(diǎn)間的連鎖不平衡( LD)和供試群體的結(jié)構(gòu)(SA)時(shí)，利用ANOVA方法可檢測到三個(gè)EST-SSR位點(diǎn)CS185、CS121和CS153與五個(gè)表型性狀顯著相關(guān)，其中標(biāo)記185同時(shí)與BL、BW、LL和LW等4個(gè)表型性狀顯著相關(guān)，標(biāo)記CS121同時(shí)與BW、LL和LW等3個(gè)表型性狀顯著相關(guān)，而CS153僅與AA顯著相關(guān)。但在考慮位點(diǎn)間的連鎖不平衡和供試群體結(jié)構(gòu)的情況下，通過回歸分析僅鑒定出2個(gè)EST-SSR標(biāo)

15、記CS153和CS84與兩個(gè)表型性狀顯著關(guān)聯(lián)，其中標(biāo)記CS153與性狀LL顯著關(guān)聯(lián)，對表型變異的解釋率為0.07，而標(biāo)記CS84與性狀TP顯著關(guān)聯(lián)，對表型的解釋率為0.35。
　　 兩種檢測方法中，僅有一個(gè)標(biāo)記CS153被同時(shí)檢出，但與之關(guān)聯(lián)的性狀卻不同。在不考慮供試樣本群體結(jié)構(gòu)的情況下，亞群的混合使整個(gè)群體所估計(jì)的LD強(qiáng)度增強(qiáng)，可能導(dǎo)致多態(tài)性位點(diǎn)與性狀的相關(guān)性并非由功能性等位基因引起，從而可能提供了假陽性結(jié)果。因此在關(guān)聯(lián)分析前